在体动物实验 1.1高脂肥胖大鼠模型的建立及分组：21日龄断乳雄性Wistar大鼠30只,体重65～75g,随机分为对照组、高脂组和烟酸组,每组10只。其中对照组(CG),予以常规商用鼠饲料；高脂组(HF),予以高脂饲料(包括10%猪油、2%胆固醇)；烟酸组(DG),予以上述高脂饲料并烟酸缓释片100mg/(kg-d),采用管饲法,共喂养12周。整个实验期间所有大鼠均自由饮水,各组每周称量体重三次,于实验12周末,分别随机处死8只大鼠取材和检测。 并且 1.2检测指标及方法 1.2.1体重和身长：各组每周测量三次体重和身长。 1.2.2外周血指标的检测：外周血甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平采用全自动生化分析仪检测；血清可溶性ICAM-1(sICAM-1)、oxLDL水平采用ELISA方法检测；血清NO水平采用硝酸还原酶比色法检测；血浆内皮素(endothelin, ET)含量采用放射免疫法检测。 1.2.3血管内皮超微结构观察：胸主动脉组织依次经戊二醛、锇酸固定、脱水、包埋,甲苯胺兰超薄切片后行透射电镜铀一铅双重染色,观察主动脉血管内皮细胞超微结构的改变。
1.2.4主动脉壁LOX-1、ICAM-1蛋白表达：冰冻切片免疫荧光染色法定性检测胸主动脉血管壁LOX-1蛋白的表达；石蜡切片免疫组化SP法检测胸主动脉血管壁ICAM-1蛋白的表达。 1.2.5 Western blot方法定量分析主动脉壁LOX-1、ICAM-1蛋白含量：提取主动脉组织标本的蛋白质样品,经变性、电泳、转膜及封闭后,先后加入稀释的LOX-1、ICAM-1一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育,经ECL显影、凝胶成像分析系统扫描蛋白条带进行光密度分析。以Β-actin作为内参,以目的蛋白/B-actin蛋白条带吸光度值作为蛋白表达强度。
1.2.6逆转录—聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法检测主动脉血管壁LOX-1、ICAM-1 mRNA的表达水平：提取各组主动脉总RNA,将mRNA逆转录成cDNA后行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳、成像分析。分别以LOX-1、ICAM-1与Β-actin扩增条带吸光度比值作为其：mRNA表达强度。 2.体外细胞试验 2.1人脐静脉内皮细胞模型(HUVECs)的建立与分组：人脐静脉内皮细胞株,用Medium200培养基(内含低血清生长增补剂LSGS)在37℃、5%CO2条件培养箱中培养,用0.125%胰蛋白酶进行消化、传代。内皮细胞呈多角形,单层铺路石状紧密排列。2%台盼蓝染色判断细胞活性,活细胞数占细胞总数96%以上,用于实验。实验分组：(1)阴性对照组：培养基；(2)LPC不同作用时间组：培养基加入终浓度为20μmol/L的LPC,分别培养0、10、30、60 http://www.selleckchem.cn/products/Ispinesib-mesilate(SB-715992).html min及4、8h；(3)烟酸(niacin)不同剂量与10μmol/L的p38-MAPK的抑制剂(SB203580)组：培养基中分别加入终浓度为0、0.25、0.5、1mmol/L的烟酸培养18h, SB203580
10μmol/L培养1h,再分别加入LPC培养8h及24h。各组细胞浓度为5×105／ml,接种于6孔板,每孔1ml。 2.2检测指标及方法 2.2.1 Western blot方法定量分析内皮细胞pp38-MAPK、p38-MAPK、ICAM-1蛋白含量：方法同1.2.5。 Epigenetics合成 Library supplier 2.2.2逆转录—聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法检测内皮细胞ICAM-1 mRNA表达：方法同1.2.6。 2.2.3实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction, Real-time PCR)法检测内皮细胞ICAM-1基因的表达：提取内皮细胞总RNA,将mRNA逆转录成cDNA后,在PRISM 7700全自动实时荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为：95℃15 s,60℃1min,共40个循环。定量分析根据ABI user manual the comparative method计算基因表达相对量,基因表达β-actin标准化公式：ΔCT= CT target-CT refernce,基因表达的不同的信号：ΔΔCt=ΔCt (gene of LPS treated group)-ΔCt (gene of untreated group),基因表达的相对倍数：2-△△CT。 2.2.4细胞免疫荧光方法检测LPC诱导的ICAM-1、NF-κB蛋白表达：将载玻片在使用之前灭菌,一次灭菌并贮存在无菌状态下。用PBS洗涤细胞(400×g离心5min),并重悬于PBS中。调整浓度至1×106／ml；将载玻片固定于甩片机的转头上,然后加入0.