收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝门部胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝门部胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的E-cadherin蛋白表达水平,并统计分析其与对应标本中FBXW7表达之间的相关性。8.应用FBXW7稳定低表达和高表达的细胞及其对照组细胞建立裸鼠转移瘤模型,观察肿瘤转移情况；通过HE染色检测肺脏及肝脏组织中转移灶数量,经体内实验验证FBXW7能否抑制胆管癌细胞转移。9.经免疫组织化学染色方法检测各组裸鼠肺脏及肝脏转移灶中FBXW7及E-cadherin表达情况,经体内实验验证FBXW7在胆管癌EMT中的调控作用。[结果]1.成功构建pBabe-shFBXW7.1及pBabe-shFBXW7.2质粒,并稳定转染HuCCTl细胞和RBE细胞(分别命名为HuCCT1-Vector、HuCCT1-shFBXW7.1、 HuCCT1-shFBXW7.2; RBE-Vector、RBE-shFBXW7.1、RBE-shFBXW7.2)。经qRT-PCR和Western
blot险测证实FBXW7低表达稳定转染细胞系构建成功。2.成功构建pBabe-FBXW7质粒,并稳定转染QBC939细胞和FRH0201细胞(分别命名为QBC939-Vector、QBC939-FBXW7; FRH0201-Vector、FRH0201-FBXW7)。经qRT-PCR和Western blot检测证实FBXW7高表达稳定转染细胞系构建成功。3.普通光学显微镜观察显示FBXW7能够抑制胆管癌细胞由上皮细胞形态向间质细胞形态转化。Western blot证实FBXW7能够促进上皮细胞标志分子E-cadherin和α-catenin的表达,同时抑制间质细胞标志分子Fibronectin和Vimentin的表达。4. Western blot证实FBXW7能够抑制干细胞特性标志分子Nanog和OCT4的表达；Primary sphere formation及Secondary Pifithrin-α订单 sphere formation实验证实FBXW7能够抑制胆管癌干细胞自我更新能力。5.经划痕实验、 Transwell小室迁移实验及Matrigel侵袭实验证实FBXW7能够抑制胆管癌细胞体外迁移和侵袭能力。6.统计学分析提示在肝内胆管癌中E-cadherin表达与肿瘤转移呈明显负相关,且其表达量与FBXW7呈正相关。7.统计学分析提示在肝门部胆管癌中E-cadherin表达与肿瘤转移呈明显负相关,且其表达量与FBXW7呈正相关。8.体内实验证实FBXW7可抑制胆管癌细胞转移能力。9.体内实验证实FBXW7可抑制胆管癌EMT。[结论]1.体内外实验证实FBXW7可抑制胆管癌EMT。2.体外实验证实FBXW7可抑制胆管癌细胞干细胞特性。3.体内外实验证实FBXW7能够抑制胆管癌细胞的迁移和侵袭能力。第三部分FBXW7抑制胆管癌上皮-间质转化、干细胞特性及转移的分子机制研究[目的]上述研究经体内外实验已经证实FBXW7能够通过抑制胆管癌EMT及干细胞特性进而抑制其转移。本部分将对FBXW7抑制胆管癌EMT的具体分子机制进行进一步探索。[方法]1.检测FBXW7高表达和低表达的细胞中mTOR及p-mTOR表达量,结合前期文献报道,明确FBXW7在胆管癌细胞中是否能够泛素化降解mTOR。2.应用mTOR特异性抑制剂rapamycin处理FBXW7低表达的细胞,经Western
JNJ-38877605数据表 blot检测EMT标志分子(E-cadherin、Vimentin)表达变化：经Primary
sphere formation及Secondary sphere formation实验检测胆管癌干细胞自我更新能力改变；经划痕实验、Transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力变化,细胞侵袭能力变化经Matrigel侵袭实验检测验证。3.应用]mTOR特异性抑制剂rapamycin处理FBXW7低表达的细胞,经qRT-PCR及Western blot检测EMT转录调控因子(Snail、Slug及ZEB1) mRNA水平及蛋白水平改变,进一步分析FBXW7调控胆管癌EMT的分子机制。4.筛选最有意义的EMT转录调控因子,首先检测其在胆管癌细胞中的表达情况；应用胆管癌细胞及FBXW7低表达的胆管癌细胞,shRNA干扰技术沉默所筛选EMT转录调控因子,经Western OSI-744研究购买 blot检测EMT标志分子(E-cadherin、Vimentin)表达变化；同时经划痕实验、Transwell小室迁移实验检测细胞迁移能力变化,细胞侵袭能力变化经Matrigel侵袭实验检测验证。5.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝内胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝内胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中所筛选EMT转录调控因子蛋白表达水平,并统计分析其与对应标本中E-cadherin及FBXW7表达之间的相关性。6.收集山东大学齐鲁医院普外科手术切除肝门部胆管癌及癌旁石蜡组织,并制成石蜡组织切片,经免疫组织化学染色检测肝门部胆管癌癌旁组织、无转移的胆管癌组织及有转移的胆管癌组织中的所筛选EMT转录调控因子蛋白表达水平,并统计分析其与对应标本中E-cadherin及FBXW7表达之间的相关性。7.对FBXW7稳定低表达细胞建立的裸鼠转移瘤模型腹腔注射rapamycin,观察肿瘤转移情况；HE染色检测肺脏及肝脏组织中转移灶数量,并与未用药组比较,经体内实验验证mTOR能否介导FBXW7调控胆管癌转移。8.对FBXW7稳定低表达细胞建立的裸鼠转移瘤模型腹腔注射rapamycin,免疫组织化学染色检测肝脏及肺脏转移灶中FBXW7及E-cadherin表达水平,并与未用药组比较,经体内实验验证mTOR能否介导FBXW7调控胆管癌EMT。[结果]1.经Western blot检测证实胆管癌细胞中FBXW7表达量与mTOR及p-mTOR呈负相关,结合前期报道,证实FBXW7在胆管癌细胞中可泛素化降解mTOR。2.经Western blot检测证实rapamycin可逆转FBXW7沉默引起的上皮细胞标志分子(E-cadherin)表达降低及间质细胞标志分子(Vimentin)表达升高；经Primary sphere formation及Secondary sphere formation实验证实rapamycin能够逆转FBXW7沉默引起的胆管癌干细胞自我更新能力增强；经划痕实验、Transwell小室迁移实验及Matrigel侵袭实验证实rapamycin能够逆转FBXW7沉默引起的胆管癌细胞体外迁移和侵袭能力增强。3.经qRT-PCR及Western blot检测证实rapamycin能够逆转FBXW7沉默引起的EMT转录调控因子Snail、Slug及ZEB1的表达增强。4.