检测弥慢性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)户Y_盒结合蛋白1(YB-1)的表达情况,探讨其与肿瘤细胞耐药、化疗疗效及预后的关系。2.体外诱导Daudi细胞多药耐药的形成,检测YB-1基因沉默前后Daudi细胞中mdr1基因诱导性表达和细胞耐药特征形成的差异,探讨YB-1蛋白在诱导性多药耐药形成中的作用。3.探讨阿霉素诱导Daudi细胞耐药过程中,YB-1核易位与核蛋白同mdr1启动子Y-box序列结合活力、mdr1基因启动子转录活性以及MAPK/ERK信号通路活化的关系。
方法：1.采用Envision两步法检测DLBCL和反应性淋巴结增生(RLH)石蜡标本中YB-1、磷酸化ERK(pERK)和P-gp的表达,分析YB-1的核定位与细胞P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)、pERK的相关性,并探讨其与临床参数的关系。2.构建针对人YB-1的特异性shRNA真核表达载体：把被9 bp序列间隔的针对YB-1不同靶序列的三个19 bp的反向重复序列及随机片段,插入携带人U6SnRNA启动子的pGensil-1质粒载体中,分别用PstⅠ和SalI酶切鉴定,并将酶切鉴定正确的重组质粒作测序分析。3.采用脂质体介导的方法将三种人YB-1基因特异性shRNA及随机片段的真核表达载体(YBX1、YBX2、YBX3、pGenesil-1/con)转染进Daudi细胞中,G418抗性筛选两周后获得阳性克隆。取YB-1基因干扰效果最好的细胞株进行后续实验,以转染随机片段的细胞株(Daudi/c)为对照组。4.阿霉素间歇性长期作用于Daudi细胞,诱导细胞耐药,RT-PCR方法检测YB-1、mdr1基因表达情况,FCM检测各组细胞mdr1基因编码的P-gp的表达水平,Western blotting法检测诱导过程中YB-1蛋白表达及其核易位的变化情况,四唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞的生长抑制率(IR)与IC50值,细胞内罗丹明123(Rho123)潴留实验检测P-gp的功能状态。5.采用凝胶迁移滞后实验(EMSA)方法检测各实验组核蛋白与mdr1启动子Y-box序列的结合活性。6.采用染色质免疫沉淀(chromatin
http://www.selleckchem.cn/products/bmn-673.html immunoprecipitation, ChIP)实验来进一‘步证实YB-1与mdrl启动子Y-box序列在细胞内特异性结合。7.合成mdrl基因启动子片段以及YB-1结合位点突变序列,克降到荧光素酶报告基因载体PGL3-Basic中,构建pMDR-luc和突变pMDR-Ym-luc重组载体；川脂质体将重组的报告基因载体与内参质粒p-半乳糖苷酶(β-gal)瞬时共同转染Daudi细胞,荧光素酶活性分析mdr1基因启动子活性的改变。8.运用MAPK抑制剂PD98059预处理Daudi细胞1小时后,再加入阿霉素诱导耐药(诱导方法同上),Western selleck化学药品 blotting法检测ERK蛋白及其磷酸化情况、YB-1蛋白表达及其核易位的变化。RT-PCR检测mdr-1, YB-1基因表达,FCM检测P-gp的表达情况。 结果：1.DLBCL组与RLH组的YB-1胞浆阳性表达率差异无显著性(P=0.763),而DLBCL组的YB-1胞核阳性表达率明显高于RLH组(P＜0.05); DLBCL临床Ⅲ-Ⅳ期、结外淋巴组织侵犯及骨髓浸润患者的YB-1胞核阻性表达率和pERK表达强度明显高于Ⅰ～Ⅱ期、结内病变及无骨髓浸润患者,差异有显著性(P<0.005)均呈正相关；化疗有效组的YB-1核阳性和pERK表达强度表达率明显低于化疗无效组(P<0.038)；化疗有效组的P-gp表达强度显著低于化疗无效组(P
血管生成在胚胎发育、机体稳态的维持、创伤修复、以及女性生理周期等生理过程中发挥着重要的作用。而且血管生成异常与多种疾病相关,包括缺血性疾病、慢性炎症以及恶性肿瘤等。促血管生成能力是非肿瘤组织细胞发生恶性转化所必须的,是重要的肿瘤恶性标志之一。对肿瘤血管生成的不断深入研究,为临床肿瘤治疗带来了许多新途径。肿瘤血管生成机制复杂多样,是目前肿瘤研究的热点问题之
Gadd45a是一种DNA损伤诱导基因,可被多种应激损伤诱导表达,包括紫外线照射、电离辐射、血清饥饿、化疗药物作用等。Gadd45a可诱导细胞周期阻滞、细胞凋亡、DNA损伤修复等。此外研究发现,Gadd45a具有多种抑瘤活性,参与维持基因组稳定性,降低MMPs转录表达,维持细胞接触性抑制和同型细胞间粘附,从而抑制细胞侵袭转移。 本研究通过体内体外实验证实Gadd45a可抑制肿瘤血管生成。Gadd45a失活可促进移植瘤内血管密度升高,增强鸡胚尿囊膜血管生成反应,以及在体外可显著增强内皮细胞迁移和成管能力。为了进一步研究Gadd45a调控血管生成的机制,我们对Gadd45a敲除和野生型的MEFs细胞进行了表达谱芯片分析,发现有五种促血管生成因子在Gadd45a敲除的MEF细胞中表达升高。其中VEGF-A是最重要的促血管生成因子,MMP3属基质金属蛋白酶,参与细胞外基质重塑。RealTime Epigenetics合成 Library购买 PCR和western blot证实VEGF-A和MMP3的变化与芯片结果相符。同时,我们发现在HeLa细胞中,敲降Gadd45a也可诱导VEGF-A和MMP3表达升高。进一步的研究发现,Gadd45a调控肿瘤血管生成与STAT3(?)目关。Gadd45a可抑制STAT3 Ser727的磷酸化。STAT3是一种重要的转录因子,其活性受到两个磷酸化位点的调节,包括Tyr705和Ser727位点。同时,VEGF-A和MMP3是STAT3调控的下游蛋白。上述结果提不,Gadd45a可通过抑制STAT3 Ser727的磷酸化,下调VEGF-A和MMP3表达。STAT3 Ser727的磷酸化可受到多种激酶调控,其中包括p38和mTOR。本研究发现mTOR特异性抑制剂Rapamycin可显著抑制这两株MEFs细胞STAT3 Ser727位点磷酸化。Pulldown实验证实GST-Gadd45a可结合mTOR,而不结合STAT3.