蛋白激酶A (PKA)水平均较对照组高,应用PKA抑制剂H-89,Treg细胞促进I型胶原形成的作用被明显抑制,BLIS法和免疫组化法得到类似结果。(5) CByB6F1小鼠亚致死量照射后,骨髓衰竭为可逆性,外周血象在第10天开始恢复,约6周恢复至正常水平,而亚致死量照射后经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞的小鼠,外周血象降低为不可逆性,造成不可逆性免疫相关骨髓衰竭。骨髓病理学检查证实骨髓衰竭,免疫相关骨髓衰竭组小鼠髓腔空虚,脂肪组织明显增多,而正常对照组和单独照射组骨髓内均无明显脂肪组织形成。骨髓脂肪化改善效果,共同输注Treg细胞和BMMSCs组和输注BMMSCs组,与输注Treg细胞组有显著差异。 结论(1)全骨髓贴壁筛选培养法可简便、高效分离、纯化BMMSCs。所获得的细胞具有BMMSCs特征性的细胞表型及向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化能力。(2)磁珠纯化小鼠脾细胞可得到足量的符合免疫表型的Treg细胞。(3)小鼠Treg细胞能促进BMMSCs成骨相关基因(BMP-2,OCN,OSX)的表达,抑制成脂相关基因(adiponectin,PPAR-γ,Leptin)的表达。(4)小鼠Treg细胞通过BMP-MARKs途径,cAMP-PKA途径促使BMMSCs向成骨方向定向分化。(5)

也许 CByB6F1小鼠在亚致死量照射后,骨髓衰竭为可逆性,经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞可诱导不可逆性骨髓衰竭,形成免疫相关骨髓衰竭动物模型,模型动物骨髓脂肪组织明显增多,BMMSCs增殖能力降低,不能传代。经输注BMMSCs,骨髓脂肪化较对照组有显著改善,且共同输注Treg细胞和BMMSCs组效果更为明显。
目的：本课题主要研究复元胶囊通过抑制Ⅱ型胶原-盘状结构域受体2（type Ⅱcollagen-discoidin domain receptor2,COLⅡ-DDR2）在骨关节炎（osteoarthritis，OA）关节软骨中的表达而影响软骨细胞肥厚分化的机制。通过培养大鼠肋软骨原代细胞，构建重组质粒载体并转染软骨细胞，检测不同DDR2表达情况下软骨细胞肥厚标志物基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinases13，MMP13）、Ⅹ型胶原（type Ⅹcollagen,COLⅩ）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的mRNA及蛋白表达情况；研究在p38、MEK信号转导通路抑制剂的作用下，软骨细胞内肥厚相关蛋白的表达情况、复元胶囊含药血清对COLⅡ-DDR2引起的肥厚软骨细胞模型表达目标蛋白的影响。以此探讨COLⅡ-DDR2对软骨细胞肥厚分化的影响、DDR2细胞内信号转导和下游分子效应、复元胶囊对软骨细胞肥厚的作用，为OA的发病机制寻找实验依据，以及为OA的药物干预提供参考。 HIF-1 cancer 方法： 1.按照mankens评分标准，选取重庆医科大学附属第一医院关节置换病人关节软骨，对OA早期标本进行HE及免疫组化染色，确定COLⅡ、DDR2在OA患者关节内是否表达；采用实时定量聚合酶链反应（Real-time

PCR）、蛋白免疫印迹（Western-blot）检测DDR2的mRNA和蛋白在OA软骨的表达。 2.大鼠肋软骨细胞培养、鉴定，用Ⅱ型胶原诱导DDR2表达上调，构建含有全长DDR2基因（Full lengthe DDR2,FD）及仅含有细胞外结构（discoidin domain,DS）基因的克隆载体,转化大肠杆菌成功后进行蓝白斑筛选，挑选菌落酶切并连接表达质粒载体，转染软骨细胞。 3.转染成功后用Ⅱ型胶原诱导肥厚软骨细胞模型，并检测相应的肥厚markers，即ALP、MMP13、COLⅩ的mRNA和蛋白的表达。 4.采用p38通路抑制剂SB203580和MEK通路抑制剂PD98059、Wnt信号通路抑制剂Dkk1孵育软骨细胞后，检测肥厚markers的表达。 5.软骨细胞分为5组，分别用复元胶囊含药血清、壮骨关节丸含药血清、空白血清进行干预，模型组细胞用Ⅱ型胶原诱导后不加干预，阴性对照组则不进行任何干预，各组检测相应肥厚markers的表达，结果进行统计学分析并得出研究结论。 结果： 1.免疫组合染色显示OA早期患者关节软骨即有COLⅡ、DDR2表达，软骨细胞HE染色可见软骨细胞增生、肥厚及凋亡现象，切片上可见软骨细胞肥厚的典型改变为“静止层-增生层-肥厚层-软骨下骨层”。

没有 2.目的基因和原核克隆载体pGEM-T连接后转化DH5α感受态细胞，携带目的基因的重组质粒在大肠杆菌中克隆，蓝白斑筛选得到纯化的重组子并和真核表达载体pcDNA3.1(+)连接，构建完成后成功转染细胞。转染后的软骨细胞经胶原诱导后获得肥厚软骨细胞模型。 3.采用RT-PCR及WT检测软骨细胞肥厚标志物mRNA及蛋白表达，PCR及WT结果均显示：转染FD组﹥模型组﹥转染DS组﹥未经胶原干预组，结果有统计学意义（p﹤0.05）。 4. SB203580、PD98059以及Dkk1和软骨细胞孵育后，采用Ⅱ型胶原诱导软骨细胞，提取mRNA及总蛋白进行目标基因及蛋白表达测定，结果显示MEK通路抑制剂PD98059对软骨细胞肥厚markers表达无明显作用，p38通路抑制剂SB203580和Wnt信号通路抑制剂Dkk1均对软骨细胞肥厚markers表达有不同程度影响，其中Dkk1对细胞表达肥厚markers有显著影响，经过数据处理，结果显示差别具有统计学意义（p﹤0.05）。 5.复元胶囊及壮骨关节丸给药后获取大鼠含药血清，软骨细胞经Ⅱ型胶原诱导后与之共同孵育，检测细胞肥厚相关基因和蛋白的表达。结果显示复元胶囊大中剂量组均对目标蛋白表达有明显的抑制作用，且大中剂量组之间无显著性差异，复元胶囊小剂量组对目标蛋白表达无明显抑制作用。差别具有统计学意义（p﹤0.05）。 结论：DDR2在OA早期表达，COLⅡ-DDR2能够促进软骨细胞早期肥厚分化，使用Wnt信号通路抑制剂能显著减弱这种作用，说明COLⅡ-DDR2细胞内信号传递可能和Wnt通路有关；复元胶囊能够抑制软骨细胞肥厚分化，其作用机理可能和抑制DDR2活化有关。
第一部分IL-1β和1α.25(OH)2D3对OPG-RANKL-RANK系统影响机制的实验研究 目的：明确OA软骨细胞中MAPKs通路与OPG-RANKL-RANK系统的关系。 方法：以SW1353细胞为研究对象，分为9组。分别以IL-1β、1.25（OH）2D3、p38信号通路抑制剂SB203580，ERK1/2信号通路抑制剂PD980959和JNK信号通路抑制剂SP600125对SW1353进行干预，模型组细胞分别以IL-1β、1.