05)。 2.2 AOH诱导转录因子ATF2激活 Western Blotting的结果表明,2.0μmol/LAOH对ATF2磷酸化水平增加不明显(P＞0.05),而10.0,20.0μmol/L的AOH能够强烈激活ATF2,与对照组相比差异有显著性(P＜0.05),显示浓度依赖关系。 20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,ATF2的活化水平逐渐增高(P＜0.05),在2 h时达到高峰,与p38的磷酸化一致,并显示时间依赖关系。

用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞,Western Blotting的结果表明,SB203580明显抑制AOH诱导的ATF2的活化,SB203580预处理组ATF2的磷酸化水平低于AOH直接处理组(P＜0.05)。提示AOH处理细胞后,ATF2的磷酸化依赖于上游p38MAPK的激活。 3.JNK通路未被AOH激活 JNK是MAPK家族成员之一,介导多种刺激引起的细胞应激反应。WesternBlotting方法检测DNA损伤剂AOH能否激活JNK通路,结果显示,AOH未能增加NIH3T3细胞中的JNK磷酸化水平,JNK抑制剂未能降低AOH对ATF2的激活作用。 4.在AOH诱导下,p38MAPK促进CREB的磷酸化 Western Blotting结果显示,p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞后,结果显示,与AOH激活组相比,SB203580预处理组中磷酸化CREB的水平降低(P＜0.05)。 第三章AOH诱导NIH3T3细胞中DNA polβ表达依赖PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路的激活 方法 1.PKA特异性抑制剂H89预处理NIH3T3细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,免疫细胞化学法和Western Blotting检测polβ的表达,同时设20.0μmol/LAOH直接作用组和溶剂对照组。 PS-341订单 点击此处 2.p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测polβ的表达,同时设20.0μmol/LAOH直接作用组和溶剂对照组。 3.H89和SB203580共同预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测PKA和p38MAPK双通路阻断对AOH诱导的NIH3T3细胞中polβ表达的影响。

4.JNK特异性抑制剂SP600125预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测AOH诱导的polβ表达,观察JNK信号通路在DNA polβ基因表达中的作用。 结果 1.PKA特异性抑制剂H89部分降低AOH诱导的polβ表达 为探讨AOH诱导的DNA polβ蛋白表达增加是否通过PKA-CREB信号通路,我们应用PKA特异性抑制剂H89预处理细胞,再用Western Blotting方法检测AOH对DNA polβ蛋白表达的影响。结果显示,H89可以部分抑制AOH诱导的DNA polβ蛋白表达,H89预处理组polβ表达水平低于AOH直接处理组(P＜0.05)。 2.p38特异性的抑制剂SB203580部分抑制AOH诱导的polβ表达 为探讨AOH诱导的DNA polβ蛋白表达增加是否通过p38-ATF2信号通路,应用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞,再用Western

Blotting方法检测AOH对DNA polβ蛋白表达的影响。结果显示,SB203580可以部分抑制AOH诱导的DNApolβ蛋白表达,SB203580预处理组polβ表达水平低于AOH直接处理组(P＜0.05)。 3.PKA和p38MAPK双通路阻断明显降低polβ表达 Western Blotting结果显示,与单独使用H89和SB203580预处理组相比,H89、SB203580联合作用明显降低AOH诱导的polβ表达(P＜0.05)。 4.JNK通路未在NIH3T3细胞中AOH诱导的polβ表达中起作用 JNK是MAPK家族成员之一,介导多种刺激引起的细胞应激反应。WesternBlotting方法检测DNA损伤剂AOH能否激活JNK通路参与polβ表达。结果表明,JNK抑制剂未能降低AOH诱导的polβ的表达,提示JNK通路未参与AOH诱导的polβ表达。 第二部分PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路激活调节DNA polβ表达在食管癌细胞EC9706中的作用 第一章食管癌EC9706细胞中PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路激活调节DNA polβ表达 方法 1.利用免疫细胞化学和Western 无 Blotting方法检测未处理的食管癌EC9706细胞中PKA催化亚基、CREB的磷酸化状态,同时用PKA特异性的抑制剂H89处理细胞2 h,观察活化的PKA、CREB的改变。 2.利用免疫细胞化学和Western Blotting方法检测未处理的食管癌EC9706细胞中p38MAPK、ATF2的磷酸化状态,同时用p38抑制剂SB203580处理细胞2 h,观察活化的p38、ATF2的改变。 3.PKA特异性的抑制剂H89和p38抑制剂SB203580单独和联合处理EC9706细胞16 h,利用免疫细胞化学和Western Blotting方法观察DNA polβ表达的变化。 4.提取未处理EC9706细胞、H89和SB203580分别处理16 h的EC9706细胞的核蛋白,经凝胶电泳阻滞实验(EMSA),分析EC9706细胞中活化的CREB、ATF2与DNA polβ启动子中CRE元件的结合活性。 结果 1.EC9706细胞中PKA-CREB通路处于激活状态 Western Blotting与免疫细胞化学结果显示,未处理的EC9706细胞中含有活化的PKA和CREB,H89可以降低其磷酸化水平。 2.EC9706细胞中p38-ATF2通路处于激活状态 Western Blotting与免疫细胞化学结果显示,未处理的EC9706细胞中含有活化的p38和ATF2,抑制剂SB203580可以降低其磷酸化水平。 3.