05~0.01），且APN10组、APN20组、APN30组三组间细胞凋亡率逐渐增加（P＜0.05)。 (3)Western-blot结果显示：与APN0组比较，APN20组、APN30组p-p38MAPK以及Caspase-3蛋白表达均显著增高(P<0.01)；与APN20组相比，APN30组p-p38MAPK以及Caspase-3蛋白表达显著增高(P<0.05)；与APN30组相比，APN30+SB组p-p38MAPK以及Caspase-3蛋白表达显著降低(P
目的： 通过组织块法培养人牙龈成纤维细胞(1uman gingival fibroblast, HGFs),观察HGFs体外培养的生物学特性,探讨人类β-防御素3(Human Beta-Defensins3, hBD3)对HGFs增殖情况的影响,通过分析hBD3及与Pg-LPS联合作用对HGFs分泌PGE2和MMP-1的情况,初步探讨此过程中可能涉及到的TLR, MAPK, PI3K, NF-κB各级信号通路。研究hBD3在牙周炎致病机制方面的作用。 方法： 1.组织块培养法体外培养人牙龈成纤维细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态,免疫组织化学方法鉴定细胞来源,3-6代细胞用于实验。 有 2.四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl terazolium, MTT)动态检测人牙龈成纤维细胞在不同浓度hBD3干预下增殖情况。
3.酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assays, ELISA)检测不同浓度hBD3不同时间点HGFs上清液中PGE2和MMP-1的含量,以及加入Pg-LPS以及不同信号抑制剂产生PGE2和MMP-1的量。 4.特定浓度hBD3,分别与等体积NF-κB信号抑制剂SN-50,50UM; PI3K信号抑制剂LY294002,20UM; JNK信号抑制剂SP600125,20UM; P38信号抑制剂SB203580,20UM; ERK信号抑制剂PD98059,10UM,分析hBD3刺激HGFs分泌PGE2和MMP-1涉及的信号通路。 结果： 1.采用组织块培养法能够在体外成功培养出HGFs。倒置相差显微镜下观察细胞胞核均染,呈长梭形,并围绕组织块呈放射状排列。抗角蛋白染色阴性,抗波形丝蛋白染色阳性,可见细胞来源于中胚层,结合取材部位证实所培养细胞为HGFs。 2.MTT检测结果显示,10ug/ml的hBD3分别与对照组和0.3ug/ml组相比,差异均有统计学意义(P
近年来随着人们对成体干细胞的研究越来越深入，发现其在组织再生和损伤修复领域发挥着非常重要的作用。牙髓干细胞作为存在于牙髓组织的一种成体干细胞，也是口腔生物学领域的研究热点。它具有很强的增殖能力，在体外经过适当的诱导又能向成骨/成牙、成脂、成神经等方向分化。同时众多的研究也发现移植到体内的牙髓干细胞能够形成牙髓牙本质复合体样结构。因此，牙髓干细胞成功体外分离为构建组织工程牙齿和牙髓损伤修复的研究提供了重大的契机。
细菌内毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌主要的致病因子。研究发现LPS能够与细胞表面特异性受体TLR4结合调控间充质干细胞的分化。而龋病致牙髓损伤时，脱矿牙本质能释放TGFβl等众多生长因子，促进牙髓干细胞向OBLC分化。而细菌及其毒性产物也会进入牙髓，接触刺激牙髓干细胞，那么细菌及其毒性产物如LPS是否影响牙髓干细胞增殖和定向分化能力？目前尚不清楚。为此，本课题在成功构建牙髓干细胞系的基础上，用LPS对牙髓干细胞进行适当的刺激，旨在探索其对牙髓干细胞增殖分化能力的影响。我们还初步分析了MAPK信号通路在LPS调控的牙髓干细胞分化过程中作用。我们的研究结果如下： 可能 1.牙髓干细胞的分离、培养和鉴定 我们通过酶消化组织块法分离培养原代细胞，采用有限稀释法对得到的原代细胞进行纯化，获得相对较为纯化均一的牙髓干细胞系。然后，我们采用了一系列针对干细胞生物学特性的方法对获得的干细胞进行了鉴定。通过流式细胞仪对细胞的表型进行分析，同时对细胞多向分化能力的进行了检测，结果均符合公认的DPSCs的生物学特征，证明我们已经成功的构建了hDPSCs细胞系。
确认细节 2. LPS对人牙髓干细胞增殖能力的影响 我们通过LPS刺激二维平面和三维立体培养的牙髓干细胞检测其对hDPSCs增殖能力的影响。不同浓度的LPS（0.01-10ug/ml）刺激二维平面培养的牙髓干细胞，MTT检测结果显示LPS在短时间的培养时间（1-5d）内对hDPSCs的增殖能力影响不大，7d时与无刺激因素的对照组相比，各刺激组均出现抑制的现象；而用1ug/mlLPS刺激复合在HA/TCP支架材料上三维立体培养的hDPSCs，电镜观察发现7d组与3d组比较细胞数目明显增多；而3d、7d分别将对照组与LPS刺激组相比细胞数目无显著差异，14d时LPS刺激组较对照组相比细胞数目明显减少。提示LPS长期刺激牙髓干细胞可能会抑制其增殖能力。 3. LPS对人牙髓干细胞定向分化能力的影响 首先，我们通过实时定量PCR检测在牙髓干细胞分化过程中TLR4及相关矿化基因表达情况，发现TLR4在牙髓干细胞表面表达，而且牙髓干细胞分化7天时表达达到最高峰，提示LPS特异性受体TLR4很可能在牙髓干细胞分化早期发挥重要作用。矿化基因DSPP、DMP1、ALP、 OPN在牙髓干细胞在分化过程中均有不同程度的升高。随后，我们分别通过实时定量PCR和茜素红染色分别检测LPS在牙髓干细胞分化过程中对矿化相关基因表达和矿化结节形成情况的影响，结果显示LPS能够显著的促进矿化相关基因DSPP、DMP1、ALP、 OPN的表达；同时LPS刺激也能促进牙髓干细胞矿化结节的形成。我们又通过电镜观察LPS对三维培养的牙髓干细胞胞外基质分泌情况的影响，发现LPS刺激能够促进牙髓干细胞分泌胞外基质及胶原纤维样结构的形成。以上结果证实LPS能够促进牙髓干细胞的定向分化为成牙本质样细胞。以上研究结果与体内牙髓损伤修复的过程类似，该部分的研究为探明牙髓损伤修复的机制提供了可靠的体外研究模型。 4.