19±8.61)% vs (47.17±10.28)%,P<0.01);与miRNA-155模拟体组比较,阻遏物组IFN-γRα蛋白表达增加,T-bet蛋白表达减少(均P<0.01),阻遏物较miRNA-155模拟体组降低(P<0.01),IFN-γRα蛋白表达低于对照组(均P0.05)。术前肌钙蛋白阳性组miRNA-155、IFN-γRα蛋白和IFN-γ表达水平与肌钙蛋白阴性组无明显差异(均P>0.05);术后12小时,肌钙蛋白阳性组与肌钙蛋白阴性组的miRNA-155、hsCRP、IFN-γ表达均显著增高(均P<0.05),且肌钙蛋白阳性组较肌钙蛋白阴性组增高更为明显(P<0.05);IFN-γRα蛋白表达显著低于(均P<0.01),肌钙蛋白阳性组较肌钙蛋白阴性组降低更为明显(P
目的:

探讨骨形态形成蛋白4(BMP4)对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的影响及其机制,为进一步探究其在低氧性肺动脉高压(HPH)发病过程的可能作用与机制打下基础。 研究内容和方法: 一、BMP4对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的影响 将200-300g雄性Wistar大鼠麻醉后,取出心肺组织,置于显微镜下,用显微镊和显微剪刀于显微镜下小心分离出远端(4-5级)肺动脉,剥离内外膜后,采用胶原酶消化法获得远端肺动脉平滑肌细胞,将细胞种于放置在35mm培养皿内的圆形载玻片上,培养至第三天细胞密度达到50%,将细胞随机分为三个组:(1)未处理组,未给予刺激物; Autophagy Compound Library (2)对照组,用等量的BMP4溶解缓冲液处理PASMCs 60h; (3)BMP4组,用BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h。细胞用Fura-2在细胞培养箱内孵育1h,使Fura-2进入细胞内,用荧光显微镜检测,根据标准曲线,推算细胞内Ca~(2+)浓度。 二、BMP4影响大鼠远端肺动脉平滑肌细胞TRPC1,6 mRNA和蛋白质表达及其机理研究 1、BMP4对PSMC表达TRPC1、6 mRNA和蛋白质的影响:实验采用原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞,培养至第五天细胞密度达到80-90%,将细胞随机分为三个组:(1)未处理组,未给予刺激物;(2)对照组,用等量的BMP4溶解缓冲液处理PASMCs 60h;(3)BMP4组,用BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h。收集细胞,用iQ SYBR Green supermix试剂实时定量细胞中的TRPC1,6 mRNA的表达;用Western Blotting检测TRPC1,6蛋白质的表达。 2、BMP4对Smad1/5/8 ,ERK1/2, p38MAPK信号通路的影响:原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞,培养至第五天细胞密度达到80-90%,将细胞随机分为七个组:(1)对照组,用等量的BMP4溶解缓冲液处理PASMCs15min;(2)BMP4(50ng/ml)处理组:分别用BMP4(50ng/ml)处理PASMCs15min、30min、1h、4h、8h、60h。收集细胞,用Western

Blotting检测BMP4对Smad1/5/8 ,ERK1/2, p38MAPK信号通路的影响。 3、BMPRⅡSiRNA、SB及PD对BMP4/Smad1/5/8 ,ERK1/2, p38MAPK信号通路的影响:用Western Blotting检测BMPRⅡ-SiRNA、PD和SB对BMP4刺激Smad1/5/8、ERK1/2和p38MAPK信号通路的影响。 selleck化学 4、SB及PD对BMP4促进大鼠远端PSMCs表达TPRC1,6mRNA和蛋白质的干预作用:原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞,培养至第五天细胞密度达到80-90%,将细胞随机分为四个组:(1)空白对照组,细胞未给予任何刺激物;(2) DMS0对照组, DMSO预处理细胞30min, BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h; (3)SB组,SB(5μM)预处理细胞30min,

BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h;(4)PD组,PD(10μM)预处理细胞30min, BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h;收集细胞,用iQ SYBR Green supermix试剂实时定量细胞中的TRPC1,6 mRNA的表达,用Western Blotting检测TRPC1,6蛋白质的表达。 5、SB或PD对BMP4增加PSMCs内钙离子浓度的影响的研究:原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞,培养至第三天细胞密度达到50%,将细胞随机分为四个组:1)空白对照组,细胞未给予任何刺激物;(2) 也许 DMS0对照组, DMSO预处理细胞30min, BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h;(3)SB组,SB(5μM)预处理细胞30min, BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h (4)PD组,PD(10μM)预处理细胞30min, BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h。细胞用Fura-2孵育,使Fura-2进入细胞内,用荧光显微镜检测,根据标准曲线,推算细胞内Ca~(2+)浓度。三、慢性低氧对小鼠肺组织内BMP内源性拮抗蛋白表达的影响 实验选用雄性的BMP4基因敲除的同种系BMP4+/+ C57BL/6J纯合子小鼠和BMP4+/- C57BL/6J杂合子小鼠,将BMP4+/+ C57BL/6J小鼠随机分为5组(n=3或4):即正常对照组、低氧1天组、低氧3天组、低氧7天组和低氧21天组。6只BMP4+/- C57BL/6J小鼠随机分成低氧1天和对照2组。将低氧小鼠置于低氧装置内,调节箱内氧浓度为10%,每天24小时持续低氧。对照组小鼠除吸入空气外,其它饲养条件与实验组相同。低氧完成后,麻醉小鼠取出心肺组织,左肺储存于-80。C冰箱备用,右肺组织提取总RNA;用实时定量PCR检测BMP内源性拮抗蛋白的mRNA表达水平。 结果: 一、BMP4能够增加大鼠远端PASMCs内钙离子浓度,未处理组、仅以溶解液处理对照组和50ng/ml BMP4处理组,[Ca~(2+)]i分别为204.07±1.22nM; 170.64±0.68nM; 415.52±3.94nM,实验组PASMC内钙离子浓度明显高于对照组,P值〈0.05。 二、BMP4能够促进大鼠远端PASMCs的TRPC1、6mRNA及蛋白的表达,未处理组和对照组比较无差异表达,与对照组比较BMP4组TRPC1,TRPC6mRNA表达量明显升高,分别上升1.69倍,2.08倍(P〈0.