2.MMP-9. Fascin. Ezrin表达的影响尚不明确。 化疗已作为常规方案列入肺癌的综合治疗,对降低肿瘤术后复发和转移的几率有一定积极意义。近年来,随着肺癌患者在围术期使用铂类药物化疗愈来愈普遍,麻醉药物是否会影响化疗药物的效果也日渐受到关注。研究表明,七氟醚可减弱顺铂对艾氏腹水肿瘤细胞的毒性作用,但七氟醚是否会影响顺铂对人肺腺癌A549细胞的抗癌效应尚不明确。 本研究采用七氟醚作用于体外培养的人肺腺癌A549细胞,并对以下三个方面进行研究：①探讨七氟醚对人肺腺癌A549细胞生长的影响及有关分子机制；②探讨七氟醚对人肺腺癌A549细胞转移能力的影响及有关分子机制；③探讨七氟醚对人肺腺癌A549细胞化疗敏感性的影响及有关分子机制。阐明上述问题将为临床麻醉工作提供一定指导意义。

第一章七氟醚对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡及有关分子表达的影响 目的观察不同浓度七氟醚对人肺腺癌A549细胞增殖、凋亡的影响,并探讨有关分子机制。 购买PR-171 方法人肺腺癌A549细胞接种于培养板,培养24h后,随机分为4组：对照组(C组,0%七氟醚)、1.7%七氟醚组(S1组)、3.4%七氟醚组(S2组)、5.1%七氟醚组(S3组)。S1、S2、S3组的A549细胞分别用1.7%、3.4%、5.1%七氟醚处理2、4、6h。C组不接受七氟醚处理。四组处理结束后,继续培养48h。于48h时,采用MTT法、平板克隆实验、流式细胞仪分别检测各组A549细胞处理2、4、6h后的增殖抑制率、克隆形成率、凋亡率。免疫印迹法检测各组A549细胞处理4h的XIAP,Survivin,Bcl-2,Bax,Caspase-3蛋白表达水平。 Selleckchem Ribociclib 统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,增殖抑制率、克隆形成率、细胞凋亡率的比较采用两因素析因设计方差分析。XIAP、Survivin、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的组间比较采用单因素方差分析。组间多重比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’s T3法(方差不齐)。PS2组(P处理4h的增殖抑制率>处理2h的增殖抑制率(P<0.05)；七氟醚处理时间的单独效应分析显示：S1、S2、S3组处理6h的克隆形成率<处理4h的克隆形成率<处理2h的克隆形成率(P0.05)

3.各组A549细胞凋亡率的比较。经析因分析发现,七氟醚处理浓度各组间凋亡率的差异有统计学意义(F=278.064,P=0.000)。七氟醚处理时间各组间凋亡率的差异有统计学意义(F=94.230,P=0.000)。七氟醚处理浓度与七氟醚处理时间这两个因素存在交互效应(F=11.440,P=0.000)。七氟醚处理浓度的单独效应分析显示：与c组比较,各个处理时间的S1、S2、S3组细胞凋亡率均依次增加(P处理4h的细胞凋亡率>处理2h的细胞凋亡率(P0.05)。 4.各组A549细胞XIAP, Survivin, Cleaved Caspase-3蛋白表达水平的比较。与C组比较,S1、S2、S3组XIAP, Survivin蛋白表达依次下调(P0.05)。 结论七氟醚能抑制A549细胞增殖,促进A549细胞凋亡。该效应与下调XIAP、urvivin蛋白表达,上调Cleaved

Caspase-3蛋白表达有关。 第二章七氟醚对人肺腺癌A549细胞的细胞周期及有关分子表达的影响 目的观察不同浓度七氟醚对人肺腺癌A549细胞的细胞周期影响,并探讨有关分子机制。 方法人肺腺癌A549细胞接种于培养板,培养24h后,随机分为对照组(C组,0%七氟醚)、1.7%七氟醚组(S1组)、3.4%七氟醚组(S2组)、5.1%七氟醚组(S3组)。S1、S2、S3组的A549细胞分别用1.7%、3.4%、5.1%七氟醚处理4h。C组不接受七氟醚处理。四组处理结束后,继续培养48h。于48h时,采用流式细胞仪检测各组A549细胞的细胞周期比例变化。免疫印迹法检测各组A549细胞处理4h后的Cyclin 因为 A, Cyclin B1, Cdc2蛋白的表达水平。 统计学处理采用SPSS13.0统计学软件进行分析,计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。组间多重比较采用LSD法。P<0.05)。Sev+SB组侵袭细胞数目显著低于其他3组(P<0.05)。Sev+SB组的细胞迁移率显著低于其他3组(P<0.05)。Sev+SB组p38MAPK磷酸化水平显著低于其他3组(P<0.05)Sev+SB组MMP-2蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)。Sev+SB组MMP-9蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)。Sev+SB组Fascin蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)Sev+SB组Ezrin蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)。Sev+DDP组侵袭细胞数目显著低于其他3组(P<0.05)。Sev+DDP组MMP-2蛋白表达显著低于其他3组(P<0.05)。Sev+DDP组的细胞迁移率显著低于其他3组(P<0.05)。Sev+DDP组Ezrin蛋白表达显著低于其他3组(P<0.

正常对照组小鼠肺泡结构基本正常,肺组织结构完整,肺泡腔清晰,肺泡间隔无增厚。LPS组肉眼可见肺脏表面淤血、出血点和水肿明显,光镜下肺泡结构破坏严重,肺泡萎陷、肺泡间隔增厚,炎细胞浸润。LPS+PCA组组织损伤程度比LPS组显著减轻,且与PCA给药浓度有关,尤以PCA高浓度组较为明显肺间质和肺泡腔内渗出物及炎细胞浸润较LPS组明显减少;LPS+SB203580、LPS+Dex、LPS+PCA+SB203580组也可见组织损伤较LPS组减轻,大部分肺泡结构清晰,肺泡间隔略增厚。2.PCA可使小鼠BALF及血清中TNF-α含量与模型组相比出现明显下降,并随PCA剂量的增多而降低,PCA高剂量组差异显著(P0.05)。阻断剂SB203580组、阳性药物地塞米松组及PCA和阻断剂组也表现出相同的作用效果,BALF及血清中含量明显低于模型组(P<0.05)。3.PCA可使小鼠BALF及血清中IL-1β含量与模型组相比出现明显下降,并随PCA剂量的增多而降低,PCA高剂量组差异显著(P0.05)。阻断剂SB203580组(P<0.05)、阳性药物地塞米松组及PCA和阻断剂组也表现出相同的作用效果,BALF及血清中含量明显低于模型组(P<0.01)。4.PCA可使小鼠BALF中蛋白浓度与模型组相比出现明显下降,并随PCA剂量的增多而降低,PCA高剂量组差异显著(P0.05)。阻断剂SB203580组(P<0.05)、阳性药物地塞米松组及PCA和阻断剂组也表现出相同的作用效果,血清中含量明显低于模型组(P<0.01)。6.LPS模型组各组肺组织中p-ATF2蛋白的表达强度较对照组显著增高(P<0.01)；PCA治疗组中p-ATF2蛋白表达量较LPS模型组相比显著降低(P<0.01),并随浓度的增高而降低。阻断剂SB203580组、阳性药物地塞米松组及PCA和阻断剂组也表现出相同的作用效果,肺组织中p-ATF2含量明显低于模型组(P<0.01)7.LPS模型组各组肺组织中TLR4蛋白的表达强度较对照组显著增高(P<0.01)；PCA治疗组中TLR4蛋白表达量较LPS模型组相比显著降低(P<0.01),并随浓度的增高而降低。阻断剂SB203580组、阳性药物地塞米松组及PCA和阻断剂组也表现出相同的作用效果,肺组织中TLR4含量明显低于模型组(P<0.01)。结论1.PCA对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠有一定的保护作用。2.PCA对脂多糖所致急性肺损伤的保护作用与PCA浓度成正相关。3.PCA可通过减少炎症介质的产生而对受损小鼠发挥保护作用。4.PCA对急性肺损伤小鼠的保护作用与抑制P38MAPK信号通路有关。5.PCA对急性肺损伤小鼠的保护作用与抑制TLR4信号通路有关。6.当同时应用PCA及SB203580后PCA对脂多糖诱导的急性肺损伤小鼠的保护作用减弱,进一步证明PCA对急性肺损伤小鼠的保护作用与其抑制P38MAPK信号通路有关。
[目的]研究高糖状态下,体外培养的小鼠前成骨细胞系(MC3T3-E1)的细胞增殖、分化、细胞外矿物质沉积的情况以及葡萄糖浓度对P38MAPK信号通路的影响,进一步探讨P38MAPK特异性抑制剂SB203580对高糖所导致的成骨细胞活性改变的影响,以阐明P38MAPK信号通路在高糖状态下成骨细胞活性中的作用。[方法]将培养的小鼠前成骨细胞系(MC3T3-E1)分为8组：1)正常对照组5.5mM葡萄糖；2)高糖组A：15.5mM葡萄糖；3)高糖组B：25.5mM葡萄糖；4)高糖组C：35.5mM葡萄糖；5)SB203580组A：5.5mM葡萄糖+10gM

确认细节 selleck化学药品 SB203580；6)SB203580组B：15.5mM葡萄糖+10μMSB203580;7)SB203580组C：25.5mM葡萄糖+10μMSB203580；8)SB203580组D：35.5mM葡萄糖+10μM Apoptosis抑制剂 SB203580。细胞接种后,待细胞生长至80%密度后,同步化24小时后,分别用以下各因素处理细胞并继续培养。1、甲基噻唑基四唑(MTT)法检测3、7、14d

MC3T3-El细胞增殖情况；2、碱性磷酸酶(ATP)试剂盒检测3d、7d细胞裂解液中ALP活性；3、茜素红染色观察细胞细胞矿化结节的大小和形态；4、荧光实时定量PCR检测核心结合因子1(core binding factor-1, Cbfal)和骨钙蛋白基因(osteocalcin, OCN)分别在培养3d、7d的表达。收集细胞,提取总RNA,逆转录cDNA,采用实时荧光定量PCR法检测各组成骨细胞中成骨相关基因的表达。5、Western blot检测P38MAPK和磷酸化P38MAPK在3d、7d的表达情况。[结果]1、与低浓度葡萄糖相比,高糖组(≥15.5mM)可抑制MC3T3-E1细胞的增殖。且经过SB203580干预后,细胞增殖水平继续下降,差异具有统计学意义。(P<0.05)。2、与低浓度葡萄糖相比,高糖组(≥15.5mM)可抑制MC3T3-E1细胞碱性磷酸酶(ALP)活性、细胞矿化和成骨相关基因的表达。SB203580干预后,ALP活性、细胞矿化及成骨相关基因(Cbfal和OCN)表达水平较未干预组升高。3、与低浓度葡萄糖相比,高糖组(≥15.5mmM)对P38MAPK,总蛋白分泌无明显的作用,但能够促进P-P38MAPK的表达且成剂量相关关系,经过SB203580干预后,可明显抑制P38MAPK磷酸化。(P<0.

1、1.0、10.0及100.0 nmol/L,干预时间均为6 h)和不同时间(空白对照组加入PBS溶液,4个干预组胰蛋白酶的终浓度均为10.0 nmol/L,相应的干预时间分别为3、6、12及24 h)的胰蛋白酶干预后,检测MKN28细胞中VEGF m RNA及其蛋白的表达水平,并检测培养液中VEGF蛋白的浓度。2将MKN28细胞分别给予PBS溶液(空白对照组)、胰蛋白酶、胰蛋白酶+PD98059、胰蛋白酶+SB203580、PD98059及SB203580处理,检测MKN28细胞中VEGF

m RNA及其蛋白的表达水平。细胞中VEGF m RNA及其蛋白表达水平的检测分别采用荧光定量PCR法和Western blot法,培养液中VEGF蛋白浓度的检测采用酶联免疫吸附实验(ELISA)。结果 BAY 73-4506研究购买 1胰蛋白酶浓度的影响。与空白对照组比较,0.1、1.0、10.0及100.0 nmol/L组细胞中VEGF m RNA及其蛋白的表达水平均较高(P0.05)。空白对照组、0.1 nmol/L组、1.0 nmol/L组、10.0 nmol/L组及100.0 nmol/L组培养液中VEGF蛋白的浓度逐渐递增(P0.05)。空白对照组、3 h组、6 h组、12 h组及24 h组培养液中VEGF蛋白的浓度逐渐递增,5组间两两比较差异均有统计学意义(P0.05),但胰蛋白酶组细胞中VEGF m RNA及其蛋白的表达水平均较其余5组相应指标高(P
目的探讨细胞外信号调节激酶/p38丝裂原活化蛋白激酶(ERK/p38MAPK)信号通路在参苓白术散调控脾虚湿困型溃疡性结肠炎大鼠结肠组织水通道蛋白(aquaporin,AQP)3、AQP4表达中的作用。方法将60只Wistar大鼠按照随机数字表均分为正常组、模型组(氯化钠注射液)、参苓白术散组、U0126+参苓白术散组、SB203580+参苓白术散组。除正常组外,脾虚湿困型溃疡性结肠炎大鼠采用2,4,6-三硝基苯磺酸/乙醇灌肠,结合环境与饮食干预复制。14 d后采用蛋白质印迹法检测各组大鼠结肠组织AQP3、AQP4蛋白的表达,实时荧光定量PCR法检测其mRNA表达情况。结果模型组大鼠AQP3、AQP4蛋白表达及其mRNA的表达水平明显低于正常组(P<0.05),参苓白术散组大鼠结肠组织AQP3、AQP4蛋白及mRNA表达较模型组明显升高,组间比较有显著性差异(P<0.05),SB203580+参苓白术散组及U0126+参苓白术散组大鼠结肠组织AQP3、AQP4蛋白及mRNA表达较模型组有较小幅度升高,与正常组和参苓白术散组相比均有显著性差异(P
目的探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)抑制剂在葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的溃疡性结肠炎大鼠肠道动力障碍中的作用。方法 34只Sprague-Dawley大鼠用随机数字表法随机分成4组:正常对照组(正常组,n=8),DSS模型组(DSS组,n=8),DSS+生理盐水(NS)组(DSS+NS组,n=9),DSS+SB203580干预组(SB203580组,n=9)。除正常组外,所有大鼠每日饮用5%DSS溶液,SB203580组大鼠在饮用5%DSS溶液72

Angiogenesis抑制剂 h以后,每天予以SB203580(1 mg/kg体质量)进行腹腔注射,观察各组大鼠的疾病活动指数(DAI),以酚红法测定大鼠结肠传输功能。结果 1 DSS组和DSS+NS组大鼠的DAI评分明显高于正常组,SB203580组DAI评分明显降低,但仍然高于正常组(P0.05)。2与正常对照组比较,DSS组和DSS+NS组大鼠的结肠传输功能明显延迟,经SB203580干预后,其结肠传输功能明显改善(P0.05)。结论 SB203580能阻断p38MAPK信号转导通路,改善DSS诱导的结肠炎症,从而改善结肠传输功能。
目的:观察P38丝裂原活化蛋白激酶(p38 ABT-263 花费 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)抑制剂SB203580对TNF-α诱导的原代培养大鼠小胶质细胞高迁移率族蛋白B1(high mobility

group protein B1,HMGB1)表达的影响。方法:采用原代培养大鼠小胶质细胞,设立对照组、TNF-α组(25 ng/m L)、TNF-α(25 ng/m L)+SB 203580组(10μmol/L)、SB203580组(10μmol/L),各组细胞经药物处理16 h后分别用ELISA法检测细胞培养上清中HMGB1的表达情况,Western印迹检测细胞HMGB1和磷酸化p38MAPK表达情况,用反转录PCR检测HMGB1 m RNA表达。结果:经TNF-α刺激后,大鼠小胶质细胞及其培养上清液中HMGB1蛋白表达增高;SB 203580可抑制TNF-α诱导的磷酸化p38 MAPK表达(P
目的探讨P38MAPK通路对肝癌细胞增殖的影响.方法描绘生长曲线、MTT、台盼兰染色、共聚焦显微镜、Western Blot和原位细胞凋亡检测.研究正常肝细胞、癌周肝硬化细胞和肝癌细胞3株细胞在P38MAPK通路阻断前后增殖情况变化.结果 P38MAPK抑制剂对肝癌细胞的增殖影响最大,随着抑制剂浓度增加,增殖越明显.而对癌周肝细胞和正常肝细胞表现为低浓度促进增殖,高浓度抑制增殖.结论阻断P38MAPK的活化可以促进肝癌细胞的增殖.
目的研究天山雪莲愈伤组织提取物(extract from callus of Saussureainvolucrate,ESI)对人成骨肉瘤细胞MG-63增殖及分化的影响,探讨ESI抗骨质疏松的作用及机制。方法以MG-63为研究对象,采用MTT法和乳酸脱氢酶(LDH)法检测ESI对成骨细胞增殖的影响,相关试剂盒检测碱性磷酸酶(ALP)活性和羟脯氨酸(Hyp)水平,茜素红染色法观察对矿化骨结节形成的影响;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测骨保护素(OPG)和核因子-κB活化因子受体配体(RANKL)基因表达水平;Western blotting法检测OPG/RANKL蛋白水平;检测p38特异性抑制剂SB203580对ESI作用于成骨细胞增殖、分化、矿化以及OPG/RANKL表达的影响。结果 ESI低于125μg/mL对成骨细胞无细胞毒性,31.25、62.

01)和ins100组(P＜0.05)明显降低；高胰岛素刺激96小时后各组细胞增殖无明显差别(P＞0.05)。高糖对BM-EPC的VEGF mRNA表达无明显影响(P＞0.05)，却剂量依赖性地抑制late EPC的VEGF表达，glucose11组和glucose30组VEGF的表达均较对照组降低(P＜0.01)。与对照组比较，11mmol／l葡萄糖刺激促进BM-EPC表达bFGF(P＜0.01)，但30mmol／l葡萄糖刺激则抑制bFGF的表达(P＜0.01)。葡萄糖呈剂量依赖性地抑制late EPC表达bFGF(ins100组vs对照组P＜0.05，ins1000组vs对照组P＜0.01)。胰岛素对BM-EPC表达VEGF无影响(P＞0.05)，1000nmol／l胰岛素抑制BM-EPC表达bFGF(P＜0.05)。胰岛素抑制late EPC表达VEGF和bFGF，ins100组和ins1000组VEGF和bFGF表达均较对照组降低(P＜0.05)，两组之间无差别。3．四氧嘧啶诱导的糖尿病组和对照组兔BM-EPC的集落形成能力以及细胞增殖、黏附能力无差别(P＞0.05)。与对照组比较，糖尿病组late EPC集落形成数量减少(P＜0.05)，细胞增殖能力下降(P＜0.01)，黏附能力也明显下降(P＜0.01)。4．BM-EPC和late EPC心肌内移植后都可以整合到血管中，形成新生血管。与对照组比较，BM-EPC移植和late EPC移植都明显增加毛细血管密度(P＜0.01)，BM-EPC组血管密度高于late

EPC组(P＜0.01)。与对照组比较，BM-EPC移植减少心肌纤维化面积(P＜0.05)，而late EPC移植则无此作用(P＞0.05)。BM-EPC移植提高射血分数(P＜0.05)，而late

EPC移植则无此作用。BM-EPC移植促进VEGF和bFGF的表达(P＜0.05)，late EPC移植组与对照组无差别(P＞0.05)。 结论：1．高糖环境对BM-EPC和late EPC功能的影响在体内和体外均存在差异。四氧嘧啶诱导的体内高糖环境对BM-EPC的数量和增殖、黏附无抑制作用，但抑制late 并且 EPC的数量、增殖和黏附。体外高糖环境呈浓度依赖性抑制late EPC的增殖，但不抑制BM-EPC的增殖。2．高糖抑制late EPC表达VEGF和bFGF，高糖对BM-EPC表达VEGF无影响，30mmol／l高糖也抑制BM-EPC表达bFGF。3．高胰岛素抑制late EPC表达VEGF以及bFGF，抑制BM-EPC表达bFGF。4．BM-EPC心肌内移植通过促进血管发生和动脉生成、旁分泌VEGF和bFGF的机制改善糖尿病兔急性心肌梗死后的血管再生，提高心功能。Late EPC移植不能改善心功能。
肝纤维化(hepatic fibrosis)是机体对慢性肝损伤的创伤-愈合反应,是各种慢性肝病发展至肝硬化的中间环节和前期病变。因此,探讨肝纤维化的发病机制为其治疗提供可靠依据、早期逆转肝纤维化具有重要的临床价值。肝星状细胞(hepatic AUY-922 花费 stellate cell, HSC)在肝纤维化的形成中起关键作用。在肝损伤及各种慢性肝病时,HSC被激活,转换为肌成纤维细胞(myofibroblastic like cells) ,表达α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA),合成各种细胞外基质成分,并且具有舒缩、黏附和定向迁移的能力。各种细胞因子和细胞信号转导途径在HSC活化过程中起着非常重要的作用。 RhoA家族蛋白是细胞骨架肌动蛋白的重要调节分子,并作为信号分子参与众多与细胞骨架有关的细胞信号传导。RhoA主要增加细胞的收缩力,促进粘着斑连接和应力纤维的装配。Rho激酶(Rho-kinase, ROCK)是目前研究最清楚的RhoA下游效应分子,作用于肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase, MLCP)使其失活,使胞浆内肌球蛋白轻链(myosin

light chain, MLC)磷酸化水平升高,肌动-肌球蛋白交联增加,从而促进肌动蛋白微丝骨架的聚合,引起细胞收缩、黏附和迁移。 Proteasome cleavage Rho蛋白与GTP结合后呈激活状态,与GDP结合呈失活状态。溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)是第一个被发现能激活Rho的物质;C3转移酶(C3 transferase)引起的ADP核糖基化可使Rho蛋白失活;法舒地尔(fasudil)是ROCK抑制剂。近年来有研究证实Rho家族蛋白在细胞迁移中发挥重要作用,Rho信号通路相关的细胞迁移与心血管、肿瘤和纤维化疾病有关。我们以前的研究工作发现整合素(integrin)-黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)信号途径参与HSC的迁移过程,黏着斑相关非激酶(focal adhesion related non-kinase, FRNK)对HSC迁移具有抑制作用。对整合素信号通路研究发现,基质不断提供信号给迁移细胞Rho蛋白影响细胞迁移。而RhoA/ROCK信号转导通路对HSC的行为影响尚不清楚。 本课题从活化的HSC细胞生物学基础研究出发,结合整体和离体试验,探讨RhoA/ROCK信号通路在肝纤维化形成中的作用以及对HSC形态、迁移和黏附的影响,为临床肝纤维化的治疗提供理论依据。实验共分三部分。 第一部分:大鼠肝纤维化组织RhoA、p-MLC和α-SMA的动态表达 目的:观察RhoA/ROCK信号转导通路关键信号分子RhoA、磷酸化的肌球蛋白轻链(phosphorylated myosin light chain, p-MLC(Thr18/Ser19))在实验性肝纤维化大鼠不同阶段肝组织中的表达规律,同时观察细胞骨架成分α-SMA在肝纤维化大鼠肝组织中的表达变化,探讨RhoA/ROCK信号转导通路在肝纤维化发生中的作用。 方法:采用胆总管结扎(bile duct ligation, BDL)方法建立大鼠肝纤维化模型;分别与手术后1wk、2wk、3wk、4wk麻醉动物,假手术组4wk麻醉动物,留取肝组织;HE及Masson三色染色观察肝纤维化大鼠的病理组织学变化;用免疫组织化学和Western blot检测RhoA、p-MLC和α-SMA的表达,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测RhoA的表达。 结果:①肝纤维化大鼠动物模型的建立:HE及Masson三色染色显示:假手术组肝小叶结构完整,肝板排列整齐。模型组随着肝纤维化逐渐发展,出现肝脏广泛结缔组织增生,中央静脉周围出现胶原纤维沉积,肝小叶结构紊乱甚至形成假小叶。②免疫组织化学显示:假手术组大鼠肝脏RhoA呈阴性表达,造模1周汇管区间质细胞呈弱阳性表达,2～3周后,着色细胞逐渐增多,在汇管区、纤维间隔、肝窦周围及增生的胆管周围细胞出现棕黄色着色,第4周着色面积进一步扩大,少数细胞可见细胞质阳性染色;造模1wk、2 wk、3 wk、4 wk大鼠肝组织内RhoA阳性分布面积为5.32%±0.41%,13.

体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞系并进行吗啡处理 Romidepsin订单 体外培养原代小胶质细胞和BV-2小胶质细胞分别分组如下：1.正常对照组、吗啡组(2,10μM)；2.正常对照组、吗啡组(10μM)、纳洛酮组(10μM)、吗啡+纳洛酮组(纳洛酮提前吗啡1h加入使之预先与阿片类受体结合)；置细胞培养箱孵育。

2.基因转染 将携带P-arrestin 2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞实验各组细胞。转染48h后,将培养基更换为不含血清的DMEM培养基,并进行后续实验。 3.细胞存活率的检测 使用MTT方法检测小胶质细胞存活率。4.细胞凋亡检测 使用TUNEL染色法检测小胶质细胞凋亡。5. Western Blotting 使用Western Blot方法检测小胶质细胞phosphor-Akt和cleaved caspase-3等蛋白水平变化。 结果 1.吗啡处理引起小胶质细胞P-arrestin 2蛋白水平降低 Western Blot结果显示,吗啡使小胶质细胞β-arrestin 2蛋白水平明显降低,而P-arrestin 1蛋白水平无明显变化。纳洛酮可阻断吗啡的作用。 2.高表达β-arrestin 2可减少吗啡引起的小胶质细胞凋亡 将携带P-arrestin 2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞,然后进行吗啡处理。MTT检测细胞存活率,发现高表达P-arrestin 2可减少吗啡处理引起的细胞存活率下降。而RNA干扰减少β-arrestin 2水平,可增加吗啡处理引起的细胞存活率下降。采用TUNEL方法检测细胞凋亡,发现高表达β-arrestin 2,可减少吗啡处理引起的细胞凋亡。而RNA干扰减少P-arrestin 2水平,可增加吗啡处理引起的细胞凋亡。Western Blot结果显示高表达β-arrestin 2,可减少吗啡处理引起的caspase-3激活,而RNA干扰减少β-arrestin 点击此处 2水平,可增加吗啡处理引起的caspase-3激活。 3.β-arrestin 2通过激活Akt发挥对小胶质细胞的保护作用 将携带β-arrestin2全长质粒、RNAi质粒和空白对照质粒转染入BV-2小胶质细胞,然后进行吗啡处理。Western

Blot结果显示,高表达P-arrestin 2可缓解吗啡引起的phosphor-Akt水平降低,而通过RNA干扰降低P-arrestin 2水平,可增加吗啡引起的phosphor-Akt降低。 结论 1.吗啡通过阿片受体途径引起小胶质细胞β-arrestin 2蛋白水平降低。 2.高表达β-arrestin 2可减少吗啡处理引起的小胶质细胞凋亡。 3.高表达β-arrestin 2通过激活Akt发挥对小胶质细胞的保护作用。
目的：1.观察在脂多糖激活原代培养大鼠小胶质细胞模型中,TNFα和HMGB1蛋白表达及TNFαmRNA和HMGB1mRNA表达的时间依赖性。2.观察NF-κB抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)和p38MAPK抑制剂SB 203580对体外TNFα诱导的原代培养大鼠小胶质细胞HMGB1蛋白表达及mRNA的影响。3.观察鞘内注射Etanercept对坐骨神经慢性挤压伤(CCI)大鼠痛阈和脊髓小胶质细胞活性、NF-κBp-p65、p-p38MAPK、HMGB1表达的调节,并探讨其临床疼痛治疗的机制。

方法：1.用脂多糖(100ng/ml)刺激原代培养大鼠小胶质细胞,根据不同的指标设定取样时间点(Oh,2h,4h,6h,8h,12h,16h,18h,24h),用ELISA法检测相应时间点细胞培养上清中TNFα和]HMGB1表达情况,用Western Blot检测细胞裂解液HMGB1表达情况,用RT-PCR检测TNFαmRNA和HMGB1 mRNA的表达。2.采用原代培养大鼠小胶质细胞,设立两部分,分别用PDTC和SB 为什么 203580处理。第一部分设立对照组、TNFα(25ng/m1)组、TNFa+PDTC组、PDTC组,第二部分设立对照组、TNFα组、TNFα+ SB 203580组、SB 203580组,均孵育16h后分别用ELISA法检测细胞培养上清中HMGB1表达情况、Western blot检测细胞HMGB1、NF-κBp-p65和p-p38MAPK表达情况,用RT-PCR检测HMGB1 mRNA表达。3.252只成年雄性SD大鼠,体质量250～300g,鞘内置管成功后,随机分为7组(n=36)：正常对照组：实验大鼠不做任何处置；假手术组：仅暴露左侧坐骨神经不结扎；假手术+Etanercept组：假手术处理大鼠并经鞘内置管注入Etanercept组；CCI组：大鼠CCI手术处理；CCI+Etanercept组。鞘内置管3d后按每组处理不同,开始鞘内输注生理盐水和Etanercept,每2d鞘内给药一次,鞘内注射2d后分别建立大鼠CCI神经病理性疼痛模型和假手术模型,测定大鼠的痛敏值,并在CCI后第3,7,13天处死大鼠,取脊髓腰膨大部进行免疫组化测定OX42表达、用Western Blot检测HMGB1、NF-κBp-p65和p-p38MAPK表达情况,用RT-PCR检测(?)HMGB1 mRNA表达。 结果：1.LPS刺激后大鼠小胶质细胞形态呈巨噬细胞样变化;TNFα的分泌于8h达峰值,细胞内及细胞外HMGB1的分泌分别于18h和24h达峰值,TNFαmRNA的表达于2h即达峰值,HMGB1mRNA自8h开始增加,12h达峰值。2.TNFα刺激后大鼠小胶质细胞裂解液及上清液中均有HMGB1蛋白表达增高,PDTC可抑制TNFα诱导的NF-κBp-p65核表达,并下调HMGB1蛋白和HMGB1mRNA的表达；SB 203580可抑制TNFα诱导的p-p38MAPK表达(P<0.01),同样下调HMGB1蛋白和HMGB1mRN的表达。3.CCI组与Sham组比较大鼠术后各时点痛敏阈值明显下降,并在术后第3d降至最低点(P<0.01),脊髓OX42、p-p65、p-p38MAPK的表达明显升高(P<0.

19±8.61)% vs (47.17±10.28)%,P<0.01);与miRNA-155模拟体组比较,阻遏物组IFN-γRα蛋白表达增加,T-bet蛋白表达减少(均P<0.01),阻遏物较miRNA-155模拟体组降低(P<0.01),IFN-γRα蛋白表达低于对照组(均P0.05)。术前肌钙蛋白阳性组miRNA-155、IFN-γRα蛋白和IFN-γ表达水平与肌钙蛋白阴性组无明显差异(均P>0.05);术后12小时,肌钙蛋白阳性组与肌钙蛋白阴性组的miRNA-155、hsCRP、IFN-γ表达均显著增高(均P<0.05),且肌钙蛋白阳性组较肌钙蛋白阴性组增高更为明显(P<0.05);IFN-γRα蛋白表达显著低于(均P<0.01),肌钙蛋白阳性组较肌钙蛋白阴性组降低更为明显(P
目的:

探讨骨形态形成蛋白4(BMP4)对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的影响及其机制,为进一步探究其在低氧性肺动脉高压(HPH)发病过程的可能作用与机制打下基础。 研究内容和方法: 一、BMP4对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的影响 将200-300g雄性Wistar大鼠麻醉后,取出心肺组织,置于显微镜下,用显微镊和显微剪刀于显微镜下小心分离出远端(4-5级)肺动脉,剥离内外膜后,采用胶原酶消化法获得远端肺动脉平滑肌细胞,将细胞种于放置在35mm培养皿内的圆形载玻片上,培养至第三天细胞密度达到50%,将细胞随机分为三个组:(1)未处理组,未给予刺激物; Autophagy Compound Library (2)对照组,用等量的BMP4溶解缓冲液处理PASMCs 60h; (3)BMP4组,用BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h。细胞用Fura-2在细胞培养箱内孵育1h,使Fura-2进入细胞内,用荧光显微镜检测,根据标准曲线,推算细胞内Ca~(2+)浓度。 二、BMP4影响大鼠远端肺动脉平滑肌细胞TRPC1,6 mRNA和蛋白质表达及其机理研究 1、BMP4对PSMC表达TRPC1、6 mRNA和蛋白质的影响:实验采用原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞,培养至第五天细胞密度达到80-90%,将细胞随机分为三个组:(1)未处理组,未给予刺激物;(2)对照组,用等量的BMP4溶解缓冲液处理PASMCs 60h;(3)BMP4组,用BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h。收集细胞,用iQ SYBR Green supermix试剂实时定量细胞中的TRPC1,6 mRNA的表达;用Western Blotting检测TRPC1,6蛋白质的表达。 2、BMP4对Smad1/5/8 ,ERK1/2, p38MAPK信号通路的影响:原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞,培养至第五天细胞密度达到80-90%,将细胞随机分为七个组:(1)对照组,用等量的BMP4溶解缓冲液处理PASMCs15min;(2)BMP4(50ng/ml)处理组:分别用BMP4(50ng/ml)处理PASMCs15min、30min、1h、4h、8h、60h。收集细胞,用Western

Blotting检测BMP4对Smad1/5/8 ,ERK1/2, p38MAPK信号通路的影响。 3、BMPRⅡSiRNA、SB及PD对BMP4/Smad1/5/8 ,ERK1/2, p38MAPK信号通路的影响:用Western Blotting检测BMPRⅡ-SiRNA、PD和SB对BMP4刺激Smad1/5/8、ERK1/2和p38MAPK信号通路的影响。 selleck化学 4、SB及PD对BMP4促进大鼠远端PSMCs表达TPRC1,6mRNA和蛋白质的干预作用:原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞,培养至第五天细胞密度达到80-90%,将细胞随机分为四个组:(1)空白对照组,细胞未给予任何刺激物;(2) DMS0对照组, DMSO预处理细胞30min, BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h; (3)SB组,SB(5μM)预处理细胞30min,

BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h;(4)PD组,PD(10μM)预处理细胞30min, BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h;收集细胞,用iQ SYBR Green supermix试剂实时定量细胞中的TRPC1,6 mRNA的表达,用Western Blotting检测TRPC1,6蛋白质的表达。 5、SB或PD对BMP4增加PSMCs内钙离子浓度的影响的研究:原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞,培养至第三天细胞密度达到50%,将细胞随机分为四个组:1)空白对照组,细胞未给予任何刺激物;(2) 也许 DMS0对照组, DMSO预处理细胞30min, BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h;(3)SB组,SB(5μM)预处理细胞30min, BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h (4)PD组,PD(10μM)预处理细胞30min, BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h。细胞用Fura-2孵育,使Fura-2进入细胞内,用荧光显微镜检测,根据标准曲线,推算细胞内Ca~(2+)浓度。三、慢性低氧对小鼠肺组织内BMP内源性拮抗蛋白表达的影响 实验选用雄性的BMP4基因敲除的同种系BMP4+/+ C57BL/6J纯合子小鼠和BMP4+/- C57BL/6J杂合子小鼠,将BMP4+/+ C57BL/6J小鼠随机分为5组(n=3或4):即正常对照组、低氧1天组、低氧3天组、低氧7天组和低氧21天组。6只BMP4+/- C57BL/6J小鼠随机分成低氧1天和对照2组。将低氧小鼠置于低氧装置内,调节箱内氧浓度为10%,每天24小时持续低氧。对照组小鼠除吸入空气外,其它饲养条件与实验组相同。低氧完成后,麻醉小鼠取出心肺组织,左肺储存于-80。C冰箱备用,右肺组织提取总RNA;用实时定量PCR检测BMP内源性拮抗蛋白的mRNA表达水平。 结果: 一、BMP4能够增加大鼠远端PASMCs内钙离子浓度,未处理组、仅以溶解液处理对照组和50ng/ml BMP4处理组,[Ca~(2+)]i分别为204.07±1.22nM; 170.64±0.68nM; 415.52±3.94nM,实验组PASMC内钙离子浓度明显高于对照组,P值〈0.05。 二、BMP4能够促进大鼠远端PASMCs的TRPC1、6mRNA及蛋白的表达,未处理组和对照组比较无差异表达,与对照组比较BMP4组TRPC1,TRPC6mRNA表达量明显升高,分别上升1.69倍,2.08倍(P〈0.

AGE-LDL对人肾小管上皮细胞Myd88和TRIF表达的影响 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL于0、5min、15min、30min、1h、3h及6小时收集细胞。Western-blot检测Myd88和TRIF蛋白表达情况。 2. Myd88/TRIF siRNA干扰后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞IL-6 mRNA 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用Myd88/TRIF siRNA 100pmol有效干扰后,分别加入100μg/ml AGE-LDL或10μtg/ml

LPS,6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。 3.阻断TLR4后,AGE-LDL对人肾小管上皮细胞Myd88和TRIF表达的影响 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用TLR4 siRNA 100pmol有效干扰后或者是20μmol/L鼠抗人TLR4抗体预孵2小时后,分别加入100μg/ml AGE-LDL刺激6h后收集细胞,Western-blot检测Myd88和TRIF蛋白表达情况。 八.AGE-LDL对人肾小管上皮细胞MAPK的影响 1. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞MAPK表达的影响 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL和10μg/ml Lumacaftor 花费 LPS于0、5min、15min、30min及1小时收集细胞。Western-blot检测MAPK激酶(p38、JNK、ERK)和磷酸化MAPK激酶(p-p38、p-JNK、p-ERK)的蛋白表达情况。 2.抑制MAPK后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞IL-6 mRNA的变化 人小管细胞上皮(HK-2细胞)DMSO、PD98059、SB203580 (p38)、SP420119 (JNK). UO126(ERK)各10μmol/ml预孵2小时后,用AGE-LDL(100μg/ml)刺激6小时,收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测IL-6 mRNA。 3.阻断TLR4后,AGE-LDL对人肾小管上皮细胞MAPK表达的影响 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用TLR4 siRNA 100pmol有效干扰后或者是20μmol/L鼠抗人TLR4抗体预孵2小时后,分别加入100μg/ml AGE-LDL刺激15min后收集细胞。Western-blot检测MAPK激酶(p38、JNK、ERK)和磷酸化MAPK激酶(p-p38、p-JNK、p-ERK)的蛋白表达情况。

九.AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-KB的影响 1. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-KB/p65表达的影响 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)分别加入100μg/ml AGE-LDL和10μtg/ml LPS于0、5min、15min、30min、1h、3h及6小时收集细胞。Western-blot检测NF-κB/p65和磷酸化NF-κB(p-p65)的蛋白表达情况。 2. AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-KB/p65的核转移 人肾小管细胞上皮(HK-2细胞)培养于置有盖玻片的6孔细胞培养板上分别加入100μg/ml AGE-LDL或10μg/ml LPS刺激0、15min和30min。固定,封闭后,加入抗人NF-κB/p65抗体一抗过夜,用非免疫兔IgG作阴性对照,Alex488荧光标记的羊抗兔二抗避光孵育45分钟,Hochest 33258染核,树脂封片。在共聚焦显微镜下观察、拍片。 3.阻断TLR4后,AGE-LDL对人肾小管上皮细胞NF-κB表达的影响 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用TLR4 siRNA 100pmol有效干扰后或者是20μtmol/L鼠抗人TLR4抗体预孵2小时后,分别加入100μg/ml 那个 AGE-LDL刺激15min后收集细胞。Western-blot检测NF-κB/p65和磷酸化NF-κB(p-p65)的蛋白表达情况。 4. Myd88/TRIF siRNA干扰后,AGE-LDL对小管上皮细胞NF-KB表达的影响 已经 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用Myd88/TRIF siRNA 100pmol有效干扰后,分别加入100μg/ml AGE-LDL或10μg/ml LPS刺激15min后收集细胞。Western-blot检测NF-KB/p65和磷酸化NF-κB(p-p65)的蛋白表达情况。 5.阻断NF-κB干扰后,AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞IL-6 mRNA的变化肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用NF-KB/p65 siRNA 100pmol有效干扰后或者是10(imol/L NF-κB/p65抑制剂Bay11-7082预孵2小时后,分别加入100μtg/mlAGE-LDL刺激6h后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测IL-6

mRNA。 十.CD36参与AGE-LDL诱导人肾小管上皮细胞表达IL-6 肾小管细胞上皮(HK-2细胞)使用CD36 siRNA 100pmol有效干扰后,或者是20μmol/L鼠抗人CD36抗体预孵2小时后,分别加入100μg/ml AGE-LDL刺激6小时后收集细胞,提取总RNA,行RT-PCR检测。 十一.统计学方法 所有数据均代表3次重复实验的结果,以X±S表示。多个样本均数的比较采用One-Way ANOVA,两两比较采用LSD和SNK。实验中不同时间点之间的同一变量比较采用独立样本t检验。所有统计由统计软件SPSS13.0完成,P0.05)。 3.3 TLR4中和抗体抑制(?)AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6 mRNA 使用鼠抗人TLR4中和抗体,可以抑制(?)AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6mRNA (F= 142.096, P=0.000)。结果示10μg/ml和20μg/ml抗体预孵细胞后,可以有效的降低AGE-LDL诱导HK-2产生IL-6 mRNA水平。 3.4阻断或中和TLR4受体,可以减少AGE-LDL促进的HK-2细胞分泌IL-6 使用鼠抗人TLR4中和抗体或siRNA干扰TLR4表达,可以抑制AGE-LDL促进的HK-2细胞产生IL-6蛋白分泌(F=165.849,P=0.000) 3.5 AGE-LDL对人肾小管上皮细胞TLR4表达的影响 本实验结果显示,AGE-LDL 100μg/ml对人肾小管上皮细胞的TLR4蛋白表达上没有影响(F=0.543,P=0.740) 四.Myd88/TRIF在AGE-LDL刺激HK-2细胞产生IL-6中的作用 4.1 AGE-LDL对HK-2细胞Myd88和TRIF表达的影响 本实验结果显示,AGE-LDL 100μg/ml对人肾小管上皮细胞的Myd88和TRIF蛋白表达没有影响(F=0.122,P=0.992) 4.2 Myd88和TRIF SiRNA分别抑制HK-2细胞表达Myd88和TRIF 使用上海吉泰生物科技公司的合成的人Myd88和TRIF siRNA,可以有效抑制HK-2细胞表达Myd88和TRIF SiRNA蛋白。 4.

5%DNFB致敏,5天后测量基础右耳廓厚度并在相同耳背处外涂10μ10.2%DNFB激发,24小时后测量耳廓厚度并取右耳组织做HE病理。PD研究：UVB曝光前1小时(A组),曝光同时(A组),曝光后6小时(C组)外涂PD98059,余步骤同前,检测耳肿反应及HE染色。SB研究：小鼠腹部去毛皮肤外涂不同浓度的SB203580,6小时后相同皮肤处外涂25μ10.5%DNFB致敏,5天后测量基础右耳廓厚度并在耳背皮肤外涂10μ10.2%DNFB激发,24小时后再次测量耳廓厚度并取耳组织做HE病理染色。各组均设对照。 结果：PD研究：UVB 8 kJ/m2及其以上剂量可引起局部免疫抑制,在此基础上,光照后6小时外涂PD98059组(C组)可部分逆转UVB诱导的局部免疫抑制,表现为和对照组相比,耳肿反应有显著性差异(P0.05)；HE染色示真皮水肿增厚伴淋巴细胞的浸润。SB研究：和对照组相比,致敏前外涂不同浓度的SB203580对接触性高敏反应无明显改变(包括耳肿反应和病理HE染色)。

结论：ERK1/2 MAPK通路在UVB诱导的皮肤免疫中起着关键作用,其抑制剂PD98059可显著逆转UVB诱导的免疫抑制,PD98059或类似物对UVB诱导的免疫抑制有预防保护作用；未观察到SB203580对迟发性性高敏反应的抗炎作用。
背景与目的 VE-821分子量 1.药物诱导γ-珠蛋白基因表达可有效治疗β-地中海贫血 γ-珠蛋白基因活化是治疗β-地中海贫血的行之有效的方法之一,是用药物诱导出生后已关闭的γ-珠蛋白基因重新开放并有效表达,改善α-和非α-珠蛋白链合成的不平衡,增加胎儿血红蛋白(fetal

hemoglobin, Hb F,α2γ2)合成,以达到减少溶血,缓解贫血症状的目的。 迄今为止,已发现多种药物具有诱导γ-珠蛋白基因表达和/或促进Hb MK 2206 F合成的作用。但不少药物存在着疗效差、毒副作用大或体内半衰期短等缺点,因此有必要开发和寻找安全高效的新药物用于治疗β-地中海贫血等血红蛋白病。 2.药物诱导γ-珠蛋白基因表达的作用机制 阐明药物诱导γ-珠蛋白基因表达机制是开发和设计高效安全药物的前提,然而目前对药物如何调控γ-珠蛋白基因重新表达、进而增加Hb F合成的作用机制尚未完全清楚。不同药物的作用机制不尽相同,目前已知的大体上可归纳为三种模式：(1)通过改变基因启动子区域染色质结构,开放染色质,促使γ-珠蛋白基因表达；(2)通过不同细胞信号通路来调控γ-珠蛋白基因表达；(3)通过改变红系细胞分化动力学来使γ-珠蛋白基因延迟关闭,提高Hb F合成。 3. p38MAPK信号介导药物诱导γ-珠蛋白基因表达的重要作用 p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPK)是主要的MAPK信号通路之一。自从10多年前发现p38MAPK信号通路介导药物诱导Hb F合成以来,此信号在药物诱导γ-珠蛋白基因表达的作用越来越受到重视。目前发现许多药物如短链脂肪酸类、组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制剂、细胞毒性药物、甚至DNA甲基转移酶(DNA methytransferase, DNMT)抑制剂等都可通过这一信号通路来发挥诱导作用。由于这些药物在药理学上有明显的区别,但它们都能通过p38MAPK信号来介导γ-珠蛋白基因表达,因此p38MAPK信号通路可能是作用机制中的重要环节。 鉴于p38MAPK的重要作用,阐明p38MAPK信号介导γ-珠蛋白基因表达的机制对于揭示药物诱导γ-珠蛋白基因的作用机制具有重要意义。但目前对p38MAPK信号如何介导γ-珠蛋白基因表达还不明了,比较明确的是p38MAPK可通过激活转录激活蛋白如cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)、激活转录因子2 (activating transcription factor 2, ATF2)等来介导γ-珠蛋白基因表达。 4.本课题组对p38MAPK信号调控γ-珠蛋白基因表达的前期研究工作 本课题组先前对p38MAPK信号调控γ-珠蛋白基因表达进行了较为深入的研究：(1)构建了稳定表达高低磷酸化p38MAPK的K562转染细胞模型用于研究。(2)首次发现除转录因子CREB和ATF2外,GATA-1活化与p38MAPK信号介导的γ-珠蛋白基因表达有密切关系。(3)通过构建siRNA敲低GATA-1的K562细胞进一步验证了GATA-1在p38MAPK信号介导γ-珠蛋白基因表达中的作用。

所以 5.染色质表观遗传修饰对γ-珠蛋白基因表达的影响 基因表达调控不仅受转录因子的影响,还与染色质结构、DNA及组蛋白表观遗传修饰的动态变化有关。近年发现,染色质表观遗传修饰在生长发育过程中β-珠蛋白基因簇不同基因表达转换的“开”与“关”中起着关键作用。某些γ-珠蛋白基因诱导药物,如DNMT抑制剂、HDAC抑制剂、短链脂肪酸等,同时也是表观遗传修饰的诱导剂,可以通过DNA去甲基化、组蛋白乙酰化来促使γ-珠蛋白基因表达,但此方面的研究还比较少。 6.研究假设：p38MAPK信号可能通过影响基因启动子区域表观遗传修饰来调控γ-珠蛋白基因表达 目前已有的研究只揭示了数个转录相关因子如CREB、ATF2、GATA-1与p38MAPK信号介导γ-珠蛋白基因表达有关,阐明p38MAPK对γ-珠蛋白基因的作用机制仍需更多的研究。目前已知p38MAPK信号激活可以活化CREB,而CREB的结合蛋白CBP和p300具有组蛋白乙酰基转移酶活性,能直接引起组蛋白乙酰化。另外,丁酸盐类药物具有HDAC抑制活性,既可通过乙酰化组蛋白、也可通过激活p38MAPK信号来诱导γ-珠蛋白基因表达。那么p38MAPK信号对γ-珠蛋白基因启动子区域的表观遗传修饰有何影响?我们假设p38MAPK信号除了可以直接作用于转录因子外,尚可通过介导γ-珠蛋白基因启动子区域表观遗传修饰的变化来调控γ-珠蛋白基因表达。有关p38MAPK与γ-珠蛋白基因启动子组蛋白乙酰化的研究报道不多,且尚有不同的意见,而p38MAPK信号对γ-珠蛋白基因启动子组蛋白磷酸化、DNA甲基化的作用尚未见报道,这是本研究的创新性之所在。 7.

L一’到10一7 mol·L一’时，气孔开度减小，抑制剂浓度为1丁“mol·L一，以上时，气孔开 度由降低到恢复，证明10一“mol.L一’是此过程浓度的转折点。 上述各种浓度的SB203580和ABA共同处理时，气孔开度均表现为 降低，但是幅度不同，当SB203580的浓度为10一6 mol·L一，时，与ABA 单独处理相比，气孔开度仅仅降低了一部分。而各浓度级别的、无活性 的 SB202474分别和ABA、执O:共同处理，不影响气孔关闭。 与表皮条分析结果一致的是:SBZo358O处理HZO:诱导的内向K+ 电流有一个变化过程，即在15min之内经历一个由减小到回升的过程， 回升后的电流值与下降前相当;而巧min内，SBZO358O使得ABA诱导

的内向K+电流减小部分地回升，并趋于稳定。 3.SB203580、SBZOZ190分别以不同方式阻断了ABA和SA诱导的 HZO:产生 SBZO358o和ABA共同处理时，保卫细胞中的DCF荧光强度没有 升高，而且BAPTA处理不影响SB203580的这一作用;SB203580注射 C59体外 进入保卫细胞后，胞外ABA处理，两个具有同样荧光基础的保卫细胞， 荧光强度对比强烈;将SB203580和H20:一起注射进入保卫细胞，再以 ABA处理，经过注射的保卫细胞DCF荧光强度低于没有注射的一方; SB203580和SA共同处理时，DCF荧光仍能升高。 SB202190和SA处理气孔、或者将SB202190注射进入保卫细胞， 以SA胞外处理，HZO:荧光强度没有升高;如果前两者的处理液中再

加入BAPTA时，玫O:荧光反而能升高。可见，SBZO358O和SBZOZ19O 以不同的方式分别抑制了保卫细胞中ABA、SA诱导的HZO:产生。 综上所述，PD98059对ABA诱导的HZO:产生、ABA和HZO:诱导 的内向K+电流减小的阻断作用，说明MEKI/2(mitogen一activated protein kinase kinasel&2)正调节ABA诱导玫O:产生，同时pD98059对HZOZ 清除作用可能是由于激活了眺O:清除系统酶活性;P38蛋白激酶探针 SBZO358O、SB20219O在ABA和SA下游信号的不同结果说明:不同的 A-1210477小白鼠 P38同源激酶在不同的玩。:产生的信号途径中起作用，对c扩+依赖性也 EPZ-6438小白鼠 不同，更显示了HZO:信号特异性。所以，蛋白激酶不仅参与胁迫信号 转导，而且特异性地调节H20:信号途径。MAPK的激活在保卫细胞HZOZ 信号的产生、放大及其专一性应答信号刺激的反应中有着重要的调节作 用。
背景 由动脉粥样硬化引起的心血管疾病是危害人类健康的常见病，研究动脉粥样硬化的发病机理及其防治对策是当今医学领域的重要课题之一。Ross认为动脉粥样硬化是一种有各种损伤因素引起的慢性增生性炎症。氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)是重要的致损伤因素，它通过其受体介导血管壁的损伤。LOX-1是1997年发现的凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体，属于C型凝集素家族的Ⅱ型膜蛋白，有学者认为Ox-LDL可以诱导LOX-1的mRNA表达，但一种受体是否有功能取决于它是否能在蛋白水平表达，而Ox-LDL是否可以诱导LOX-1在蛋白水平表达及组织细胞定位在国内还未见报道，LOX-1是否参与Ox-LDL引起的损伤也是需要明确的问题。内皮细胞是一个十分活跃的代谢及内分泌器官，其功能众多，本课题以内皮细胞为对象探讨这一问题。

一系列大型一、二级冠心病预防研究结果均显示他汀类药物对血脂紊乱及冠状动脉事件危险性的理想防治效果，降脂益处已无可争辩，他汀类药物抗炎、稳定斑块、抑制血管平滑肌细胞增殖等非降脂作用也日益受到重视，本实验研究阿托伐他汀对Ox-LDL诱导的内皮细胞表达LOX-1及其它生物学效应如ICAM-1、MCP-1 mRNA表达、NO分泌等的影响，以探讨阿托伐他汀的非降脂作用和潜存的治疗价值。 第一部分 Ox-LDL诱导LOX-1基因和蛋白表达及在细胞中的定位 方法：采用一步梯度法分离LDL，铜离子法制备Ox-LDL，将不同浓度Ox-LDL(20，40，60，80mg／L)与内皮细胞共孵育24h及浓度40mg／L的Ox-LDL作用内皮细胞不同时间(0、3、6、12、24h)，半定量RT-PCR检测LOX-1在转录水平表达，细胞酶联免疫法测定LOX-1在蛋白水平表达，免疫组化观察LOX-1蛋白在内皮细胞 浙江人学博卜学位论文 的定位，免疫印迹法检测p38 MApK表达。 结果:1.加入Ox一LDL 20m留L使Lox一1 mRNA和蛋白表达量增加(尸0.05)，而比4omg/Lox一LDL组增加( 1.44士0.14)倍(p<0.01)、(43.35士5.61)%(P<0.05)，而较ox一LDL组增加(1.19+0.

蛋白激酶A (PKA)水平均较对照组高,应用PKA抑制剂H-89,Treg细胞促进I型胶原形成的作用被明显抑制,BLIS法和免疫组化法得到类似结果。(5) CByB6F1小鼠亚致死量照射后,骨髓衰竭为可逆性,外周血象在第10天开始恢复,约6周恢复至正常水平,而亚致死量照射后经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞的小鼠,外周血象降低为不可逆性,造成不可逆性免疫相关骨髓衰竭。骨髓病理学检查证实骨髓衰竭,免疫相关骨髓衰竭组小鼠髓腔空虚,脂肪组织明显增多,而正常对照组和单独照射组骨髓内均无明显脂肪组织形成。骨髓脂肪化改善效果,共同输注Treg细胞和BMMSCs组和输注BMMSCs组,与输注Treg细胞组有显著差异。 结论(1)全骨髓贴壁筛选培养法可简便、高效分离、纯化BMMSCs。所获得的细胞具有BMMSCs特征性的细胞表型及向脂肪细胞、成骨细胞及软骨细胞分化能力。(2)磁珠纯化小鼠脾细胞可得到足量的符合免疫表型的Treg细胞。(3)小鼠Treg细胞能促进BMMSCs成骨相关基因(BMP-2,OCN,OSX)的表达,抑制成脂相关基因(adiponectin,PPAR-γ,Leptin)的表达。(4)小鼠Treg细胞通过BMP-MARKs途径,cAMP-PKA途径促使BMMSCs向成骨方向定向分化。(5)

也许 CByB6F1小鼠在亚致死量照射后,骨髓衰竭为可逆性,经尾静脉注射母本小鼠淋巴细胞可诱导不可逆性骨髓衰竭,形成免疫相关骨髓衰竭动物模型,模型动物骨髓脂肪组织明显增多,BMMSCs增殖能力降低,不能传代。经输注BMMSCs,骨髓脂肪化较对照组有显著改善,且共同输注Treg细胞和BMMSCs组效果更为明显。
目的：本课题主要研究复元胶囊通过抑制Ⅱ型胶原-盘状结构域受体2（type Ⅱcollagen-discoidin domain receptor2,COLⅡ-DDR2）在骨关节炎（osteoarthritis，OA）关节软骨中的表达而影响软骨细胞肥厚分化的机制。通过培养大鼠肋软骨原代细胞，构建重组质粒载体并转染软骨细胞，检测不同DDR2表达情况下软骨细胞肥厚标志物基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinases13，MMP13）、Ⅹ型胶原（type Ⅹcollagen,COLⅩ）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的mRNA及蛋白表达情况；研究在p38、MEK信号转导通路抑制剂的作用下，软骨细胞内肥厚相关蛋白的表达情况、复元胶囊含药血清对COLⅡ-DDR2引起的肥厚软骨细胞模型表达目标蛋白的影响。以此探讨COLⅡ-DDR2对软骨细胞肥厚分化的影响、DDR2细胞内信号转导和下游分子效应、复元胶囊对软骨细胞肥厚的作用，为OA的发病机制寻找实验依据，以及为OA的药物干预提供参考。 HIF-1 cancer 方法： 1.按照mankens评分标准，选取重庆医科大学附属第一医院关节置换病人关节软骨，对OA早期标本进行HE及免疫组化染色，确定COLⅡ、DDR2在OA患者关节内是否表达；采用实时定量聚合酶链反应（Real-time

PCR）、蛋白免疫印迹（Western-blot）检测DDR2的mRNA和蛋白在OA软骨的表达。 2.大鼠肋软骨细胞培养、鉴定，用Ⅱ型胶原诱导DDR2表达上调，构建含有全长DDR2基因（Full lengthe DDR2,FD）及仅含有细胞外结构（discoidin domain,DS）基因的克隆载体,转化大肠杆菌成功后进行蓝白斑筛选，挑选菌落酶切并连接表达质粒载体，转染软骨细胞。 3.转染成功后用Ⅱ型胶原诱导肥厚软骨细胞模型，并检测相应的肥厚markers，即ALP、MMP13、COLⅩ的mRNA和蛋白的表达。 4.采用p38通路抑制剂SB203580和MEK通路抑制剂PD98059、Wnt信号通路抑制剂Dkk1孵育软骨细胞后，检测肥厚markers的表达。 5.软骨细胞分为5组，分别用复元胶囊含药血清、壮骨关节丸含药血清、空白血清进行干预，模型组细胞用Ⅱ型胶原诱导后不加干预，阴性对照组则不进行任何干预，各组检测相应肥厚markers的表达，结果进行统计学分析并得出研究结论。 结果： 1.免疫组合染色显示OA早期患者关节软骨即有COLⅡ、DDR2表达，软骨细胞HE染色可见软骨细胞增生、肥厚及凋亡现象，切片上可见软骨细胞肥厚的典型改变为“静止层-增生层-肥厚层-软骨下骨层”。

没有 2.目的基因和原核克隆载体pGEM-T连接后转化DH5α感受态细胞，携带目的基因的重组质粒在大肠杆菌中克隆，蓝白斑筛选得到纯化的重组子并和真核表达载体pcDNA3.1(+)连接，构建完成后成功转染细胞。转染后的软骨细胞经胶原诱导后获得肥厚软骨细胞模型。 3.采用RT-PCR及WT检测软骨细胞肥厚标志物mRNA及蛋白表达，PCR及WT结果均显示：转染FD组﹥模型组﹥转染DS组﹥未经胶原干预组，结果有统计学意义（p﹤0.05）。 4. SB203580、PD98059以及Dkk1和软骨细胞孵育后，采用Ⅱ型胶原诱导软骨细胞，提取mRNA及总蛋白进行目标基因及蛋白表达测定，结果显示MEK通路抑制剂PD98059对软骨细胞肥厚markers表达无明显作用，p38通路抑制剂SB203580和Wnt信号通路抑制剂Dkk1均对软骨细胞肥厚markers表达有不同程度影响，其中Dkk1对细胞表达肥厚markers有显著影响，经过数据处理，结果显示差别具有统计学意义（p﹤0.05）。 5.复元胶囊及壮骨关节丸给药后获取大鼠含药血清，软骨细胞经Ⅱ型胶原诱导后与之共同孵育，检测细胞肥厚相关基因和蛋白的表达。结果显示复元胶囊大中剂量组均对目标蛋白表达有明显的抑制作用，且大中剂量组之间无显著性差异，复元胶囊小剂量组对目标蛋白表达无明显抑制作用。差别具有统计学意义（p﹤0.05）。 结论：DDR2在OA早期表达，COLⅡ-DDR2能够促进软骨细胞早期肥厚分化，使用Wnt信号通路抑制剂能显著减弱这种作用，说明COLⅡ-DDR2细胞内信号传递可能和Wnt通路有关；复元胶囊能够抑制软骨细胞肥厚分化，其作用机理可能和抑制DDR2活化有关。
第一部分IL-1β和1α.25(OH)2D3对OPG-RANKL-RANK系统影响机制的实验研究 目的：明确OA软骨细胞中MAPKs通路与OPG-RANKL-RANK系统的关系。 方法：以SW1353细胞为研究对象，分为9组。分别以IL-1β、1.25（OH）2D3、p38信号通路抑制剂SB203580，ERK1/2信号通路抑制剂PD980959和JNK信号通路抑制剂SP600125对SW1353进行干预，模型组细胞分别以IL-1β、1.