5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L)作用于人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3,采用实时荧光定量PCR法检测基因SOX7、β-catenin和cyclin D1分别在肿瘤细胞中表达水平的变化。(3)采用MTT法检测不同浓度阿司匹林刺激对人上皮性卵巢癌SKOV3细胞增殖活性的影响,并计算肿瘤细胞的抑制率。采用SPSS19.0统计软件对数据进行统计学处理,定量资料以均数±标准差()表示,符合正态分布的两组数据间比较采用独立样本t检验,正态分布的多组数据之间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),多个样本均数之间的两两比较使用LSD-t检验,两组数据变量的关联性分析采用Pearson相关。以α=0.05作为检验水准。结果1

没有 SOX7、β-catenin和cyclin D1在上皮性卵巢癌患者肿瘤组织和正常卵巢组织中的含量:SOX7、β-catenin和cyclin D1在正常卵巢组织和上皮性卵巢癌患者肿瘤组织中的表达情况分别是:SOX7,6.102±0.781 vs 1.701±1.104,t=3.614,P=0.001;β-catenin,2.312±0.267 vs 9.214±0.351,t=13.651,P
目的:巨噬细胞作为固有免疫的第一道屏障,能通过诱导T细胞募集和活化来促进适应性免疫,对外来病原体的防御、清除和直接杀伤肿瘤细胞并提呈肿瘤相关抗原起着至关重要的作用。在不同细胞因子构成的微环境影响下,巨噬细胞分化为不同的功能表型。M1型巨噬细胞具有杀灭细菌和肿瘤细胞的能力;M2型巨噬细胞则具有组织修复和促进肿瘤细胞增殖、侵袭及抑制T细胞与自然杀伤细胞免疫活性等能力。M1型和M2型巨噬细胞数量上是一种动态平衡,若失衡则会导致病理性疾病的发生。因此,随着探讨极化巨噬细胞抑制和促进肿瘤进展的双重作用机制的不断深入,本课题为将来的基因治疗提供重要的实验依据。载脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apo E)是一种分子量为35k Da的糖蛋白,其m RNA广泛表达于肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、皮肤、脑和各种细胞(如巨噬细胞、卵巢颗粒细胞),主要功能是调节血浆蛋白、脂蛋白的运输及代谢过程。大量文献提示,Apo E参与肿瘤的发展过程,与肝细胞株相比,肝癌细胞株Hep 查找更多 G2中Apo E蛋白水平显著增加,但Apo

E在卵巢癌细胞中的表达增加却预示预后良好。这些结果表明,Apo E在人类肿瘤中的作用并不一致,究竟是什么原因导致Apo E的作用有如此大的不同?肿瘤细胞分泌的前列腺素E2(PGE2)是肿瘤微环境中一种重要的因子,其抑制活化巨噬细胞中CCL5 m RNA和蛋白的表达。炎症和炎性介质是肿瘤微环境的重要贡献者。为此,本研究利用LPS和PGE2模拟肿瘤微环境,以小鼠巨噬细胞株RAW264.7为模型,通过建立高表达Apo E的RAW264.7细胞株,研究Apo E在肿瘤微环境下对RAW264.7细胞细胞因子分泌、功能表型分化的影响,以期为肿瘤免疫治疗提供新的理论视角。方法:1应用Lipofectamine 2000瞬时转染Apo E,建立高表达Apo E细胞株,SYBR Green荧光染料法实时定量PCR检测Apo

E的表达。2实时定量PCR检测瞬时转染Apo E的RAW264.7细胞IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和i NOS m RNA表达;利用流式细胞仪检测巨噬细胞表面标志分子CD86和CD206表达情况。3 http://www.selleckchem.cn/products/Vandetanib.html Western blot检测与炎症、增殖等MAPK相关蛋白(P-p38、P-ERK 1/2)的表达。结果:1构建了高表达Apo E的瞬时转染RAW264.7细胞株,SYBR Green荧光染料法实时定量检测Apo E的表达,结果显示,与RAW264.7细胞株相比,Apo E表达水平增高5.1±0.4倍,具有统计学意义。2实时定量PCR检测活化巨噬细胞炎性细胞因子表达,结果显示,与对照组相比,在RAW264.7细胞和高表达Apo E RAW264.7细胞株中,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA表达均增加,但高表达Apo E RAW264.7细胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6表达增高倍数明显低于RAW264.7细胞,差异有统计学意义。3实时定量PCR检测PGE2刺激后巨噬细胞炎性细胞因子的表达,结果显示,与RAW264.7细胞相比,高表达Apo E RAW264.7细胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10表达降低,差异有统计学意义。4实时定量PCR检测PGE2刺激活化巨噬细胞炎性细胞因子的表达,结果显示,与对照组相比,在RAW264.7细胞和高表达Apo E RAW264.7细胞株中,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA表达明显增加,但高表达Apo E RAW264.7细胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10表达增加倍数明显低于RAW264.

动物模型的建立及分组：选用健康雄性6-8周龄Wistar大鼠66只(清洁级)随机分成：对照组、模型组和乌司他丁干预组,对照组按1、3、6h分为3个亚组,模型组和干预组按0.5、1、3、6h分为4个亚组,共11组,每组6只。模型组大鼠给予LPS(5mg/kg)尾静脉注射,干预组大鼠在尾静脉注射LPS(5mg/kg)前30min给予UTI(50000单位/kg)尾静脉注射。对照组大鼠给予尾静脉注射等量的生理盐水(NS)。整个实验期间所有大鼠均喂标准饲料,实验前禁食12h,自由饮水。 2.标本采集：各组动物在相应的不同时点分别给予3%戊巴比妥钠腹腔麻醉打开并暴露胸腔,肉眼观察肺组织大体病理改变。经左心室穿刺抽血,离心后留取血清置于-80℃冰箱保存。取血结束后立即留取肺部标本,取左肺计算肺组织湿／干重比值(W/D)；取右肺上叶以10%中性甲醛固定以备HE染色和免疫组化染色。取右肺中、下叶放入液氮中冻存,-80℃保存,以备Western

blot及Real Time RT-PCR检查。 3.常规HE染色并计算肺组织病理损伤评分。 4. ELISA法检测血清中TNF-α和IL-10的浓度。 5. Real Time RT-PCR法检测肺组织中TNF-αmRNA的相对表达量。 6.免疫组化法检测磷酸化的p38 MAPK蛋白在肺组织中的表达。 7. Western blot法检测肺组织中磷酸化的p38 MAPK的表达。 8.统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件包分析。计量资料用means±SD表示,各组之间的差异采用单因素方差分析(one-way

Roxadustat订单 ANOVA),其后两两之间比较采用LSD检验,p100次／分),口唇发绀,精神萎靡,少动少食,抓取时无力逃避,3h组和6h组各有1只大鼠死亡,濒死前出现抽搐,大小便失禁,深大呼吸,四肢僵硬,解剖后肉眼见肺组织体积增大,脏层胸膜张力较高,表面色泽暗红,可见包膜下点状、片状出血,切面疏松,有黄色或淡红色液体溢出,尤以6h组最为明显；干预组各时点表现相对较轻,所有动物均存活,抓取时能够逃避,解剖后肺有类似上述改变,但范围小,程度轻,体积增大不明显,表面呈红色,可见少量出血点。 哪里 2.肺组织湿／干重比值(W/D)的变化：模型组大鼠肺组织的W/D在3h和6h明显高于对照组(p
研究背景 多器官功能障碍综合症(MODS)是引起严重烧伤患者死亡的主要原因之一。虽然引起MODS的病理生理过程纷繁复杂,但随着研究的深入人们逐渐达成共识,血管内皮细胞的功能紊乱是这一病理生理过程的中心环节。而在严重烧伤早期,血管内皮细胞的功能紊乱主要表现为烧伤后内皮细胞“毛细血管渗漏”及随之而来的间质水肿。 危重病患者时常伴有胰岛素抵抗和高血糖,而这种“创伤后胰岛素抵抗”的严重程度往往反映了这些危重病患者(如严重创伤、严重烧伤及脓毒症)的死亡风险。在一个外科重症监护病房的前瞻性研究中,人们发现强化胰岛素治疗来严格控制血糖水平可明显减少严重感染、器官衰竭以及死亡率。在关于其机制的探讨中,一些研究人员认为代谢调节机制是强化胰岛素治疗的唯一作用途径。然而,近年来人们逐渐发现胰岛素还具有抗炎、抗凋亡、促细胞增殖以及调节机体免疫功能的特性。也就是说胰岛素除了具有代谢调节特性外还具有非代谢作用机制。近期又有研究报道强化胰岛素治疗具有内皮细胞保护作用并认为其可能是阻止危重病患者多脏器衰竭和死亡的重要机制。但到目前为止,危重病患者强化胰岛素治疗的确切机制仍不清楚。 很少 在本课题中,我们主要是探讨胰岛素对严重烧伤后内皮细胞功能紊乱的调节作用。首先,在体严重烧伤动物模型上,利用强化胰岛素处理观察其对急性肺损伤的作用。我们的设想是强化胰岛素处理是否可以通过对微血管内皮细胞的保护,防止微血管渗漏,从而达到减轻烧伤后肺组织水肿、出血及炎性细胞浸润的目的。在此基础上,我们进一步体外利用脐静脉血管内皮细胞,观察胰岛素干预后内皮细胞单分子通透性与细胞紧密连接以及凋亡的变化和内在联系,并就可能存在的细胞内信号传导机制进行相关研究。

方法 1.雄性SD大鼠75只,随机分成假烫组、烫伤组(30% TBSAⅢ○),烫伤+胰岛素处理组。氧化酶法测定烫伤后24小时内大鼠血糖变化。烫伤12小时后,HE染色观察肺脏病理变化,检测肺脏髓过氧化物酶(MPO)、血清超氧化物歧化酶(SOD)以及支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量变化。同时,电镜观察肺微血管内皮细胞变化,比色法检测各型一氧化氮合酶及血清一氧化氮(NO)水平。 2.体外培养原代人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC),随机分为空白对照组、20%(V/V)人正常血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清+胰岛素处理组及抑制剂(LY-294002)组,利用生物素标记的BSA测定内皮细胞单分子通透性变化,罗丹明-鬼笔环肽标记细胞骨架并观察,同时利用蛋白印迹法检测带状闭合蛋白-1(ZO-1)、咬合蛋白及磷酸化蛋白激酶B(AKT)的变化情况。 3.体外培养的原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC),随机被分为空白对照组、20%(V/V)人正常血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清刺激组、20%(V/V)人烧伤血清+胰岛素处理组,刺激6小时后运用原位末端标记(TUNEL)法观察内皮细胞凋亡,分别采用免疫组织化学染色法和(或)蛋白印迹法检测抗凋亡蛋白bcl-2及eNOS的蛋白表达情况。 4.体外原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC),随机被分为空白对照组、20%(V/V)正常人血清刺激组、20%(V/V)烧伤人血清刺激组、20%(V/V)烧伤人血清+胰岛素(10-7mol/L)处理组及抑制剂(LY-294002)组。ELISA法检测采集血清中IL-1β和TNF-α的水平。刺激6小时后,蛋白印迹法检测HUVEC胞浆抑制酶κB-α(IκB-α)和胞核NF-κB-p65的蛋白表达变化。 结果 1.

7中验证前期蛋白组学得到的差异蛋白簇受P38MAPK信号通路的调控,用免疫组化技术检测118例样本中差异蛋白簇磷酸化P38、Galectin-3和MAWBP的表达并分析其与溃疡性结肠炎临床特点的相关性和作为复合标志物的可能性。 2、运用Microarray和多种分子生物学方法揭示差异蛋白MAWBP在溃疡性结肠炎中的作用、功能和分子机制。首先通过免疫组化和Western

Blot检测MAWBP结合蛋白MAWD在溃疡性结肠炎中的表达和定位,进而通过免疫共沉淀实验确定两者相互结合。通过构建真核表达载体转染Caco-2细胞来分别及共同高表达MAWBP和MAWD,Microarray技术分析其基因表达谱,进而通过Real-time PCR和Western Blot验证差异基因。最后通过干扰RNA技术敲低MAWBP和MAWD的表达,进一步从反方向验证MAWBP和MAWD与ERK通路的关系。 3、运用DASL技术在转录水平对溃疡性结肠炎活动期和静止期的基因表达谱进行分析,挑选同一病人同一部位的活动期和静止期内镜下标本共29例,对差异基因进行生物信息学分析,进一步通过Real-time PCR和免疫组织化学染色方法验证差异基因的表达。 4、统计学分析：我们用SPSS13.0软件来进行所有的数据分析；Pearson chi-square检验和Fisher’s确切概率法来分析蛋白质表达与疾病病理特征之间的关系；方差分析及后续的基于方差分析的多重比较方法来分析Real-time NU7441小白鼠 PCR结果和基因组学差异基因结果；P0.5为强相关。 那个 结果 1、我们用Western Blot技术验证了与P38MAPK通路相关的差异蛋白质簇与溃疡性结肠炎的相关性。细胞水平进一步验证了差异蛋白簇受P38MAPK通路的调控。然后从该蛋白质簇中选取了三种可以指示P38MAPK通路活化状态的蛋白,磷酸化P38,Galectin-3和MAWBP,免疫组化结果显示这三种蛋白质与溃疡性结肠炎特异相关(χ2=41.509, P0.72)。Western Blot验证了MAWBP和MAWD高表达能够激活ERK通路,以及干扰RNA敲低MAWBP和MAWD的表达后能够抑制ERK通路。 3、运用DASL对溃疡性结肠炎活动期和静止期的基因表达谱进行分析,共发现上调基因909个,下调基因823个,其中上调组基因主要涉及了炎症反应、结直肠肿瘤癌基因和EMT,下调组基因主要涉及了结直肠肿瘤抑癌基因和PPAR通路。通过Real-time

PCR验证了结直肠肿瘤相关癌基因MMP1、MMP3、CHI3L1和CHRDL2,抑癌基因ABCG2和PLA2G12B在UC活动期中有显著的差异表达(P
第一部分血清抵抗素水平与川崎病的相关性研究 目的：川崎病是一种急性发热性疾病，主要发生在婴幼儿及年龄小的儿童，常伴有冠状动脉损伤。由于15%-25%的患儿有发生冠状动脉瘤的危险，所以近年来引起了儿科医生的极大关注。抵抗素是新近发现的一种脂肪细胞来源的肽类，属于一类富含半胱氨酸残基的分泌性蛋白家族，有研究发现抵抗素可能参与了炎症过程，且与冠脉动脉钙化，粥样硬化等疾病的发生发展密切相关。因以，本研究探讨血清抵抗素水平与川崎病患儿及其发生冠脉动脉瘤的相关性。 方法:用酶联免疫吸附试验检测了165例儿童血清抵抗素水平，并将其分为4组：健康对照组（n＝85），无冠脉动脉损伤的川崎病患儿组（N=41），伴冠脉扩张的川崎病患儿组（N=31），并发冠状动脉瘤的川崎病患儿组（N=8）。同时统计其血液学指标,包括血白细计数（WBC），红细胞计数（RBC），血红蛋白水平（HB），红细胞压积（Hct），血小板计数，C-反应蛋白（CRP）和红细胞沉降率（ESR）。

结果:与正常对照组及川崎病患儿其他组相比，伴有冠肪动脉瘤的川崎病患儿血清抵抗素水平明显的升高，此外血红蛋白水平明显降低；且在患儿组，血清抵抗素水平与其CRP水平呈显著正相关关系，而与患儿红细胞水平呈负相关。 Galunisertib分子量 结论:抵抗素和血红蛋白可能与川崎病患儿冠状动脉瘤的发生有关，血清抵抗素的表达上调可能与川崎病急性期的炎症因子增加有关。第二部分抵抗素基因启动子-420C/G多态性与儿童川 崎病的相关性研究 目的：川崎病（KD）是一种小儿全身性血管炎，通常伴发冠状动脉病变（CAL）。抵抗素为近年来发现的一种脂肪细胞来源的肽类，可能与炎症反应及冠脉动脉疾病的发生密切相关。-420C> G多态性位点位于抵抗素基因（RETN）启动子区域，新近研究显示该区位点多态性在炎症发生及心血管疾病中起到了重要作用。然而，RETN启动子多态性与川崎病之间的关联尚不清楚。故本研究拟探讨抵抗素基因多态性（－420C/G）与儿童川崎病易感性及其临床特征的相关性。 方法：共计91名川崎病患儿，115名正常对照组儿童纳入本研究。依照诊断标准将川崎病患儿分为了完全性（cKD）和不完全性川崎病（iKD）。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF)进行抵抗素启动子基因多态性分型。采用夹心酶联免疫法（ELISA）对所有血清样本抵抗素蛋白浓度进行测定。 结果：KD组和健康对照组抵抗素基因（-420C>G）的基因型和其等位基因频率进行了比较，然而差异无统计学意义（P〈0.05）。此外，该基因位点多态性与川崎病的CALS的发生也无明显差异。然而，G等位基因的频率在iKD组明显高于cKD组（P＜0.05），GG基因型也在iKD组显著增加（P＜0.05）。KD组血清抵抗素水平明显高于对照组（P＜0.

Real-time PCR等方法检测细胞衰老分泌表型,观察DEX共处理对TIS及SASP的影响,并进一步通过流式细胞分析、成球培养、Western-blot. shRNA等方法来探讨其具体机制。 结果：DEX共处理可以导致PEM的疗效降低,促进肿瘤的侵袭和迁移。DEX共处理可减弱PEM所致的细胞衰老样生长停止,改变肿瘤细胞衰老相关的促炎及促分裂因子分泌表型,即SASP。DEX共处理增加了NSCLC细胞的自我更新、克隆形成等能力,使部分肿瘤细胞出现干性特征。此外,在DEX共处理组Bcl-2表达增加,通过抑制剂ABT737以及shRNA来抑制Bcl-2表达可抑制肿瘤细胞生长和克隆形成能力。 点击此处 结论：DEX通过改变SASP抑制PEM的抗肿瘤作用,这是基于Bcl-2依赖方式的肿瘤细胞自我更新能力改变。
脑胶质瘤是一种恶性程度高并且预后差的脑部肿瘤,占脑部全部肿瘤的50%以上。目前脑胶质瘤的标准治疗方法是最大程度的切除肿瘤,然后经过放射治疗,同时辅以替莫唑胺化疗,这样可以显著地增加患者的生存期,但是仍有多于90%的患者复发,并且表现出强烈的放化疗抵抗。为了更好地了解脑胶质瘤放疗抵抗的分子机制,我们按照临床放疗标准对脑胶质瘤细胞T98G单克隆进行gamma射线照射总剂量60Gy后挑选8个放疗抵抗单克隆,采用表达谱芯片和拷贝数变异芯片分别检测照射前后差异表达的基因和CNV片段,比较不同单克隆间差异表达的基因和CNV片段,并结合两种芯片的结果筛选候选基因进行易感性和功能研究。

两种芯片的结果都表现出8个单克隆中差异表达的基因或者CNV片段既有相同的部分,又有各自特异的方面。表达谱结果中差异表达的基因数目最多的单克隆中有3473个差异基因,最少的有168个。CNV芯片的结果中差异CNV片段最多的单克隆中有380个,最少的有235个。分别统计两种芯片中差异基因的数目及出现频率,表达谱数据中总共有4303个差异表达的基因,其中有199个与TCGA数据库中报道的跟生存期相关的基因一致,这些差异的基因在5个以上单克隆中出现的共有4个基因,分别为S100A4、BMP2、LGALS3和NNMT.

GSK1120212数据表 CNV数据中差异CNV区域包含的基因共有14215个,其中含有最多数目的单克隆中有7274个基因,最少的单克隆中有3103个基因。两种芯片中共同存在的差异基因共有1243个,其中在6个单克隆中都出现的有两个基因(ATP6V1D和SAT1),在5个单克隆中出现的基因有4个,在5个单克隆中出现的基因有13个。 表达谱数据中热图的结果显示,脑胶质瘤细胞8个单克隆可以分为2个大支。GO分析分别统计了每个单克隆中差异最显著的前30个项目,其中在多个克隆中都富集到的项目有溶酶体、ECM与受体相互作用、细胞黏附、Wnt通路、TGF-β通路、乏氧与p53、氨酰-tRNA合成以及谷胱甘肽代谢等,通路分析的结果与GO分析的结果一致。 EPZ-6438小白鼠 CNV芯片的LOH结果显示,T98G细胞总共有23个LOH区域,片段大小从3M到108.9M不等,A549细胞总共有21个LOH区域,片段大小从4.2M到95.6M不等。两者共有9个CNV区域相同。与T98G细胞相比,不同单克隆中差异的LOH区域的数目也各不相同,其中相同的片段主要集中在1、7、8和16号染色体。单亲二倍体(UPD)的分析中,我们发现T98G对照细胞在9号和17号染色体存在UPD,但是放射前后没有变化,而A549细胞没有检测到UPD的存在。

基于表达谱芯片和CNV芯片的结果,我们筛选出LGALS3基因作为功能研究的候选基因。LGALS3基因在5个单克隆中表达上调,并且在5个单克隆中拷贝数增加,两种芯片中有3个单克隆中既表达上调,同时又存在拷贝数增加,而且LGALS3的表达量还跟生存期相关,因此被选为候选基因,进行功能研究,由于辐射是脑胶质瘤发生的一个重要的危险因素,因此我们同时研究LGALS3基因的遗传多态性与脑胶质瘤发病风险之间的关系。 LGALS3基因是半乳糖凝集素家族的一员,在细胞间、细胞质以及细胞核内都有表达,参与了细胞不同的生物功能,如增殖、细胞黏附、血管生成和凋亡等,在肿瘤的发生发展过程中具有重要的作用,但是在脑胶质瘤的研究不多。 为了研究LGALS3基因遗传多态是否跟脑胶质瘤的患病风险相关,我们在华东地区收集了961例经神经病理诊断为胶质瘤的病人和1351例的健康对照人群,对LGALS3基因的5个标签SNP位点进行基因分型,探讨LGALS3基因的遗传多态性对脑胶质瘤患病风险的影响。 单位点分析发现,rs4644位点的突变纯合型AA对比于野生型CC可以显著的增加脑胶质瘤的患病风险,校正后的OR=2.15,95%CI=1.25-3.72, P=0.006。在隐性模型中,AA基因型对比于CC+CA基因型可以显著的增加脑胶质瘤的患病风险,校正后的OR=2.10,95%CI=1.22-3.62, P=0.007。rs4652位点突变纯合型CC与野生型AA相比能够增加脑胶质瘤的发病风险,校正后的OR=1.29,95%CI=1.00-1.67,但是P值处于临界状态0.054。分层分析中,rs4644位点的AA基因型在男性和GBM中都可以显著的提高脑胶质瘤的患病风险,校正后的OR值分别为2.07和2.81,95%C1分别为1.04-4.12和1.46-5.38。rs4652位点的CC基因型在女性和GBM中显著的增加患病风险,校正后的OR值分别为1.56和1.44,95%CI分别为1.03-2.37和1.01-2.

小鼠C 17.2及大鼠PC-12表现为抑制增殖的作用,且其抑制作用具有浓度依赖性,HL-5201的浓度越大,抑制增殖的活性越强；而对于人MDA-MB-231、小鼠脾细胞、小鼠RAW 264.7、小鼠BV-2则表现为双向作用,在浓度较高时,表现为抑制增殖作用,低浓度时则表现为促进增殖的活性。2)HL-5201对幼龄小鼠各阶段体质量增重影响的结果显示,HL-5201仅在第1-5

d,以50 mg/kg剂量灌胃给药时能提高小鼠的平均日增重,增重率为7.8%,与空白对照组比较有显著性差异(P=0.016),其余剂量与时间段对小鼠的平均日增重均无影响(P>0.05)。3)HL-5201对人HepG-2细胞株具有明显的促进增殖作用及拮抗MMC的细胞毒作用,且促增殖和拮抗作用的最适作用浓度为45μmol/L,最适作用时间为72 点击此处 h。4)倒置显微镜下我们观察到空白对照组以及HL-5201组的细胞生长状况良好,细胞伸展呈梭型及多角形,细胞透亮,生长旺盛。经细胞计数后,HL-5201组的细胞数量要比空白对照组多,说明HL-5201具有促进细胞增殖的作用。而人HepG-2经丝裂霉素C (MMC)作用之后,倒置显微镜下可观察到细胞变圆,贴壁不牢固,有大量漂浮细胞,生长受到明显的抑制等现象。MMC+HL-5201组在倒置显微镜下可见细胞生长状况明显改善。经过细胞计数后,MMC+HL-5201组细胞的总数明显比MMC模型组多,而凋亡细胞数量比MMC组少。说明HL-5201能够抑制MMC对人HepG-2诱导凋亡的作用。5)经DAPI染色后,在荧光显微镜下可观察到空白对照组和HL-5201组的细胞核形态呈圆形,边缘清晰,染色均匀呈淡蓝色,细胞成片生长。HL-5201组的完整细胞核的数量明显多于空白对照组。MMC模型组经DAPI染色后,从荧光强度以及核形态可以鉴别出细胞发生凋亡的典型特征——细胞核固缩,染色质致密呈斑块状浓集于核膜下,可见明显的凋亡小体。MMC和HL-5201共同作用于人HepG-2,在荧光显微镜下虽然也能观察到很多凋亡小体,但MMC+HL-5201组完整细胞核的数量明显多于MMC凋亡组,而凋亡小体则明显少于MMC凋亡组。由此说明HL-5201能够通过促进细胞增殖以及抑制细胞凋亡的途径以达到增加细胞数量,延长生存时间的目的。6)我们通过PI染色流式细胞仪观察,发现HL-5201作用于人HepG-2细胞株后,其对细胞周期分布的影响不明显,只观察到与MMC模型组比较,MMC+HL-5201组的亚二倍体细胞数(凋亡细胞)下降4.7%,有统计学意义(P=0.045),其余相同细胞周期的细胞百分率两两比较,均没有统计学意义(P>0.05)。7)从JC-1染色结果中我们可以观察到MMC组的HepG-2细胞经MMC作用之后线粒体膜电位下降,并且与空白对照组相比有显著性差异(P=0.000)。而经HL-5201作用后,我们可发现HL-5201除了能稳定正常的线粒体膜电位之外,还能稳定被MMC损伤的线粒体膜电位,提示其可抑制线粒体凋亡途径的开启,从而关闭后续的凋亡反应。8)

Western blotting实验结果表明,与空白对照组相比,HL-5201组的Phospho-Akt(Ser 473)、Phospho-Bcl-2(Ser PLX3397 也许 70)、Phospho-Bad(Ser 112)蛋白的含量明显增加,Bad、Bax的表达则明显减少,对Akt、Bcl-2以及线粒体内部的Cytochrome C蛋白表达无明显影响。而当HL-5201与MMC合用后,与MMC模型组相比,HL-5201亦能明显上调Phospho-Akt(Ser 473)、 Phospho-Bcl-2(Ser 70)、Phospho-Bad(Ser 112)的水平,下调Bad、Bax的表达,以及将Cytochrome C蛋白稳定在线粒体内部。因此可以认为HL-5201通过调节上述蛋白基因的表达以及磷酸化,从而促进细胞的增殖分裂并拮抗MMC对人HepG-2细胞诱导的凋亡作用。9)

Caspase-3和Caspase-9活性检测结果显示,MMC明显提高两者的活性,HL-5201作用于MMC诱导的HepG-2凋亡模型后,Caspase-9的活性由9.55U下调为7.12 U,有显著性差异(P=0.000),Caspase-3的的活性由8.64 U,下调为6.59 U,有显著性差异(P=0.009)。提示HL-5201可能通过抑制Caspase-3酶原及Caspase-9酶原的活化,进而抑制MMC诱导人HepG-2细胞的凋亡。10)MTT比色法检测信号通路阻断剂、蛋白酶或基因转录抑制剂对HL-5201作用于人HepG-2代谢活力变化的结果显示,与空白对照组相比,HL-5201对人HepG-2细胞的代谢活力或增殖具有明显的促进作用(P=0.000)。酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein、PI3K抑制剂LY 294002和Wortmannin、PKA抑制剂H 89. MAPKK抑制剂PD 98059和U 0126、p38 MAPK抑制剂SB203580、JAK-2抑制剂AG 490、JNK抑制剂SP 600125、蛋白酶体抑制剂MG 132、基因转录抑制剂Actinomycin D均能明显抑制HL-5201促进HepG-2细胞代谢活力,与HL-5201组比较均有显著性差异(P值均等于0.000)；而NF-κB抑制剂BAY 11-7082对HL-5201促进HepG-2细胞代谢活力无影响(P=0.220)。11)MTT比色检测HL-5201(5s)结构类似物对HepG-2增殖代谢活力及拮抗MMC细胞毒作用实验结果显示HL-5201(5s)、5b、5m、5n四个化合物对人HepG-2具有促增殖作用,但作用强度有差异。其中,4个化合物中5b在浓度为90μmol/L时对HepG-2促增殖效果最好,增殖率为44.91%。5n在浓度为60μmol/L对HepG-2促增殖作用具有统计学意义,但增殖效应仅为3.36%。5s、5b、5m对MMC所致人HepG-2的细胞毒性作用具有不同程度的拮抗作用。其中45 p.mol/L的HL-5201(5s)对MMC的拮抗作用最好,达19.

05)。 2.2 AOH诱导转录因子ATF2激活 Western Blotting的结果表明,2.0μmol/LAOH对ATF2磷酸化水平增加不明显(P＞0.05),而10.0,20.0μmol/L的AOH能够强烈激活ATF2,与对照组相比差异有显著性(P＜0.05),显示浓度依赖关系。 20.0μmol/L的AOH作用NIH3T3细胞不同时间,Western Blotting的结果表明,随着作用时间的延长,ATF2的活化水平逐渐增高(P＜0.05),在2 h时达到高峰,与p38的磷酸化一致,并显示时间依赖关系。

用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞,Western Blotting的结果表明,SB203580明显抑制AOH诱导的ATF2的活化,SB203580预处理组ATF2的磷酸化水平低于AOH直接处理组(P＜0.05)。提示AOH处理细胞后,ATF2的磷酸化依赖于上游p38MAPK的激活。 3.JNK通路未被AOH激活 JNK是MAPK家族成员之一,介导多种刺激引起的细胞应激反应。WesternBlotting方法检测DNA损伤剂AOH能否激活JNK通路,结果显示,AOH未能增加NIH3T3细胞中的JNK磷酸化水平,JNK抑制剂未能降低AOH对ATF2的激活作用。 4.在AOH诱导下,p38MAPK促进CREB的磷酸化 Western Blotting结果显示,p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞后,结果显示,与AOH激活组相比,SB203580预处理组中磷酸化CREB的水平降低(P＜0.05)。 第三章AOH诱导NIH3T3细胞中DNA polβ表达依赖PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路的激活 方法 1.PKA特异性抑制剂H89预处理NIH3T3细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,免疫细胞化学法和Western Blotting检测polβ的表达,同时设20.0μmol/LAOH直接作用组和溶剂对照组。 PS-341订单 点击此处 2.p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测polβ的表达,同时设20.0μmol/LAOH直接作用组和溶剂对照组。 3.H89和SB203580共同预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测PKA和p38MAPK双通路阻断对AOH诱导的NIH3T3细胞中polβ表达的影响。

4.JNK特异性抑制剂SP600125预处理细胞1 h,再加入20.0μmol/L AOH作用细胞16 h,Western Blotting检测AOH诱导的polβ表达,观察JNK信号通路在DNA polβ基因表达中的作用。 结果 1.PKA特异性抑制剂H89部分降低AOH诱导的polβ表达 为探讨AOH诱导的DNA polβ蛋白表达增加是否通过PKA-CREB信号通路,我们应用PKA特异性抑制剂H89预处理细胞,再用Western Blotting方法检测AOH对DNA polβ蛋白表达的影响。结果显示,H89可以部分抑制AOH诱导的DNA polβ蛋白表达,H89预处理组polβ表达水平低于AOH直接处理组(P＜0.05)。 2.p38特异性的抑制剂SB203580部分抑制AOH诱导的polβ表达 为探讨AOH诱导的DNA polβ蛋白表达增加是否通过p38-ATF2信号通路,应用p38特异性抑制剂SB203580预处理细胞,再用Western

Blotting方法检测AOH对DNA polβ蛋白表达的影响。结果显示,SB203580可以部分抑制AOH诱导的DNApolβ蛋白表达,SB203580预处理组polβ表达水平低于AOH直接处理组(P＜0.05)。 3.PKA和p38MAPK双通路阻断明显降低polβ表达 Western Blotting结果显示,与单独使用H89和SB203580预处理组相比,H89、SB203580联合作用明显降低AOH诱导的polβ表达(P＜0.05)。 4.JNK通路未在NIH3T3细胞中AOH诱导的polβ表达中起作用 JNK是MAPK家族成员之一,介导多种刺激引起的细胞应激反应。WesternBlotting方法检测DNA损伤剂AOH能否激活JNK通路参与polβ表达。结果表明,JNK抑制剂未能降低AOH诱导的polβ的表达,提示JNK通路未参与AOH诱导的polβ表达。 第二部分PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路激活调节DNA polβ表达在食管癌细胞EC9706中的作用 第一章食管癌EC9706细胞中PKA-CREB和p38MAPK-ATF2通路激活调节DNA polβ表达 方法 1.利用免疫细胞化学和Western 无 Blotting方法检测未处理的食管癌EC9706细胞中PKA催化亚基、CREB的磷酸化状态,同时用PKA特异性的抑制剂H89处理细胞2 h,观察活化的PKA、CREB的改变。 2.利用免疫细胞化学和Western Blotting方法检测未处理的食管癌EC9706细胞中p38MAPK、ATF2的磷酸化状态,同时用p38抑制剂SB203580处理细胞2 h,观察活化的p38、ATF2的改变。 3.PKA特异性的抑制剂H89和p38抑制剂SB203580单独和联合处理EC9706细胞16 h,利用免疫细胞化学和Western Blotting方法观察DNA polβ表达的变化。 4.提取未处理EC9706细胞、H89和SB203580分别处理16 h的EC9706细胞的核蛋白,经凝胶电泳阻滞实验(EMSA),分析EC9706细胞中活化的CREB、ATF2与DNA polβ启动子中CRE元件的结合活性。 结果 1.EC9706细胞中PKA-CREB通路处于激活状态 Western Blotting与免疫细胞化学结果显示,未处理的EC9706细胞中含有活化的PKA和CREB,H89可以降低其磷酸化水平。 2.EC9706细胞中p38-ATF2通路处于激活状态 Western Blotting与免疫细胞化学结果显示,未处理的EC9706细胞中含有活化的p38和ATF2,抑制剂SB203580可以降低其磷酸化水平。 3.

7% vs 50.41±3.59%, P=0.02)。4)与抵抗素组(50ng/ml)比较,SB203580预处理后,抵抗素对血小板的激活率明显降低(25.22±8.34% vs 51.74±5.2%, P
背景 肠易激综合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是一种慢性功能性肠道疾病,发病率呈上升趋势,IBS的主要特点是内脏敏感性增高,但其神经生物学机制尚不完全清楚,故对其发病机制研究有较重要意义。新近研究表明,神经胶质细胞在内脏痛反应中可能起较为重要作用,尤其是脊髓中支配左半结肠的骶髓后联合核(Dorsal commissual nucleus, DCN)中神经胶质细胞与IBS内脏高敏感性可能具有密切相关性,也成为目前研究的热点问题。 目的 本实验采用旋毛虫感染大鼠成功制作IBS大鼠模型,通过对模型大鼠的①结肠扩张刺激,观察脊髓背角中NMDAR(N-methyldaspartate

receportes, NMDAR)、CGRP(Calcitoningene-related peptide, CGRP)和DCN中小胶质细胞的变化；②给予椎管内插管注射小胶质细胞上MAPK-38特异性抑制剂SB203580,观察脊髓背角中MAPK-P38、ERK以及DCN中小胶质细胞的变化,为进一步研究IBS内脏敏化的神经生物学机制提供理论依据。 方法 用旋毛虫悬液灌胃建立IBS模型,采用电生理学方法观察正常大鼠和IBS大鼠腹直肌肌电的变化；采用免疫荧光组织化学方法观察两者骶髓后角中NMDAR、CGRP、MAPK-P38、ERK以及骶髓后联合核中的小胶质细胞的表达情况。 Selleck Etoposide 结果 IBS结肠刺激组大鼠腹直肌肌电、大鼠骶髓后角中NMDAR、CGRP表达以及DCN中的小胶质细胞活化程度较正常大鼠及IBS未刺激组均显著增强(P<0.01)。IBS大鼠予以结肠扩张性刺激,其骶髓后角中P38、ERK表达较正常大鼠明显升高,同时OX42表达明显增高,二者相比差异显著(P<0.01),而当给予抑制剂SB203580后P38表达明显下降,同时OX42水平降低(P0.05)。 还有 结论 IBS内脏高敏感性可引起骶髓DCN中小胶质细胞的变化,其反应与小胶质细胞存在密切关系。IBS的内脏敏化可能是通过DCN中小胶质细胞的MAPK-P38信号转导途径实现的。
目的：牙周炎是人类最普遍的口腔疾病之一,它不仅是牙列缺损乃至缺失的主要原因,也是某些全身疾病如糖尿病、心血管疾病、妊娠并发症的危险因素。近一百年来,对牙周疾病的研究不断深入,其致病机理仍有诸多未解之谜,以往研究已经证实咬合创伤可参与牙周炎的发生与发展,并直接影响牙周组织的改建与修复。牙周膜成纤维细胞作为牙周膜中的主要感受性细胞和效应性细胞,在适宜的周期性应力作用下,可发生增殖、迁移、分化和凋亡,参与组织的适应性改建。本研究拟在成功构建成纤维细胞体外培养一力学刺激模型的基础上,采用流式细胞术及RT-PCR等先进检测技术,从分子和基因水平探讨周期性张应力诱导成纤维细胞凋亡的相关机制,初步阐明P38MAPK信号通路在周期性张应力诱导成纤维细胞凋亡中的作用,明确周期性张应力、细胞凋亡及P38MAPK信号通路三者的关系,为全面诠释咬合创伤的致病机理以及探寻咬合创伤干预治疗的关键靶点提供理论依据和新的思路。

方法：以体外培养的成纤维细胞为实验对象,采用多通道细胞牵张应力加载系统,分别对待测细胞施加0h,6h,12h,24h周期性张应力。实验分为加力组(0h,6h,12h,24h)及加力+SB203580组(0h,6h,12h,24h)共八组。细胞所受力值大小以加力板底部硅胶膜的拉伸形变率(%)表示,拉伸形变率越大,表示成纤维细胞所受张应力越大。本实验细胞所受形变率为12%,频率为6循环/分钟,即每循环包括5秒钟牵张和5秒钟松弛。通过流式细胞术分析细胞的凋亡率,RT-PCR检测Bax蛋白的表达情况。加力之前对细胞施加P38MAPK特异性抑制剂SB203580,然后再对细胞施加相同的张应力之后再检测细胞的凋亡率及Bax蛋白的表达情况。应用SPSS10.0统计软件对实验数据进行统计学分析。 那个 结果： 1.细胞培养获得了性状稳定的成纤维细胞,并成功构建了成纤维细胞体外培养-力学刺激模型。 2.形变率为12%、频率为6循环/分钟的周期性张应力可诱导成纤维细胞的凋亡,成纤维细胞的凋亡率随加力时间的延长而增加,达到最高峰后开始下降,24小时内仍高于未加力组(p<0.05)；阻断p38MAPK信号通路后,凋亡基因bax的表达量降低(p
目的：翼外肌在错(?)畸形的发展及诊疗的各个阶段中起着重要作用,可以受到外环境改变的刺激而发生适应性改建。本研究在成功构建成肌细胞体外培养—力学刺激模型的基础上研究P38MAPK信号通路在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用。

方法：本实验将实验细胞分为对照组和抑制剂组。对每组细胞分别施加0小时,6小时,12小时和24小时的周期性张应力。加力设备采用多通道细胞牵张应力加载系统,加力的力值设定为15%,每分钟10循环,每循环包括3s牵张,3s松弛。应用Hoechst33258和光学显微镜检测细胞凋亡的形态学变化；RT-PCR和流式细胞术检测细胞凋亡情况；Western Blot检测信号通路中P38MAPK蛋白P-P38MAPK蛋白的表达变化情况。实验结果应用SPSS17.0软件分析处理。 结果：光学显微镜可见持续张应力的作用下,骨骼肌成肌细胞发生不同程度的凋亡。Hoechst 33258检测观察到细胞受力后细胞核固缩并出现凋亡小体。RT-PCR和流式细胞术结果显示随加力时间的延长细胞凋亡率增加(P<0.05),抑制剂SB203580组的凋亡率明显小于对照组,且P38MAPK蛋白和P-P38MAPK蛋白的表达均受明显影响(P
背景无菌松动是人工关节置换术后常见的并发症,目前认为磨损产生的磨损碎屑诱导假体周围骨溶解是最主要的原因。近年来,对磨屑导致的骨溶解反应进行了广泛研究,但对其中的细胞、分子机制仍不是十分清楚。基质金属蛋白酶2在骨组织代谢过程具有重要作用,参与维持骨形成与骨吸收平衡。有研究报道基质金属蛋白酶2在假体周围骨溶解过程也具有重要作用,然而有关这方面的研究相对较少。目的研究钛颗粒对成骨细胞表达基质金属蛋白酶2基因的影响情况以及相关的调节机制,以探讨成骨细胞在假体周围骨溶解的作用,进一步了解磨损颗粒导致骨溶解的相关机制。 方法MC3T3-E1鼠前成骨细胞与不同浓度负荷的钛颗粒体外混合培养,分别于第2、4、6、8天RT-PCR检测MMP-2 mRNA表达情况。然后,p38特异性抑制剂(SB203580)预处理MC3T3-E1细胞后与0.1mg/ml浓度负荷的颗粒共同培养,Western-blot法和免疫荧光检测磷酸化p38的蛋白表达水平,同时检测MMP-2 mRNA的表达情况。 结果钛颗粒增加MC3T3-E1细胞MMP-2 mRNA和磷酸化p38蛋白的表达水平。不同的颗粒负荷组别间MMP-2 mRNA表达水平存在显著差异(F=295.097, P=0.000)。各时间点的表达水平也存在差异(F=23.757, P=0.

获取雄性、6-8周龄C57BL/6小鼠的骨髓细胞，经含重组鼠白细胞介素-3（Recombinant murine Interleukin-3, rmIL-3）和重组鼠干细胞因子（Recombinant murine Stem cell factor，rmSCF）培养体系诱导骨髓细胞向肥大细胞分化，观察细胞形态，4-6周后收集悬浮细胞，甲苯胺蓝染色和流式细胞仪检测鉴定MCs。3.给予不同浓度的AGE-LDL刺激分化成熟的MCs，分别检测其释放组胺及β-己糖胺酶水平，评价AGE-LDL刺激mBMMCs活化脱颗粒的能力。4．对可能介导AGE-LDL激活肥大细胞的受体的研究：（1）实时定量聚合酶链反应（Real-timequantitative polymerase chain reaction, Real-time PCR）、流式细胞仪和western-blot检测mBMMCs表面TLR4的基因和蛋白表达。（2）检测TLR4基因敲除（TLR4knockout,TLR4KO）的MCs经AGE-LDL干预后的组胺及β-己糖胺酶释放水平。5．研究AGE-LDL影响肥大细胞活性可能的信号通路：(1）用AGE-LDL刺激肥大细胞，分别在不同时间点用Western-blot分析核因子κB（Nuclear-κB, Abiraterone体内 NF-κB）、p38MAPK、ERK1/2及JNK磷酸化情况。(2）分别用NF-κB、p38、ERK1/2抑制剂PDTC、SB203580、PD98059预孵肥大细胞后，再给予AGE-LDL刺激，观察细胞释放组胺和β-己糖胺酶的情况。

研究结果：1.在人颈动脉斑块标本中观测到肥大细胞浸润及AGEs的沉积。2.经rmIL-3和rmSCF在体外诱导小鼠骨髓细胞4-6周后，甲苯胺蓝染色显示超过99%的细胞被染成蓝紫色，流式细胞仪检测细胞表面分子CD117和FcεRIa表达，双阳性率超过95%，鉴定为成熟的肥大细胞。3.AGE-LDL呈浓度依赖性地激活肥大细胞释放组胺和β-己糖胺酶，在30分钟时达到峰值，与对照组和非糖化低密度脂蛋白（n-LDL）组相比差异均有统计学意义（p
背景 还有 葡萄膜炎是指累及葡萄膜、视网膜、视网膜血管和玻璃体的一大类炎症性疾病的总称。根据葡萄膜炎病因及临床表现不同，可将其分为100余种。葡萄膜炎多发于青壮年，表现为慢性或反复发作的眼部炎症，且其造成的眼组织损害是不可逆的，可导致不可逆性盲目。Behcet病和Vogt-小柳原田综合征是我国各种葡萄膜炎中最为常见也是致盲率最高的葡萄膜炎类型。目前认为，Behcet病为一种自身炎症性疾病，而Vogt-小柳原田综合征为一种自身免疫性疾病。两者的病因目前还不清楚，但感染和免疫反应被认为均参与了两种疾病的发生。模式识别受体（pattern-recognition

receptors，PRR）是固有免疫的重要组成部分，在机体抵抗外来微生物感染中发挥了重要的作用。模式识别受体在接触到外来微生物后可以将其转化为适应性免疫，激活免疫细胞，促进炎症因子释放，进而引发炎症反应消除外来微生物。但是，模式识别受体表达及功能的异常可以导致免疫系统紊乱，从而导致疾病的发生。 本研究正是基于上述背景，进行了以下两大方面的实验：1、探讨模式识别受体在Behcet病和Vogt-小柳原田综合征患者中的表达，以期寻找到差异表达的模式识别受体。2、进一步探讨差异表达的模式识别受体在Behcet病和Vogt-小柳原田综合征发病中所起的作用。通过上述研究，以期能对以上两种疾病的发病机制有一个深入的了解，同时为其预防和治疗寻找到新的靶点和突破口。 第一部分模式识别受体在Behcet病发病中作用的研究 目的： 探讨模式识别受体在Behcet病发病中的作用。 方法： 分别抽取活动期Behcet病患者、静止期的Behcet病患者、急性前葡萄膜炎患者（acute anterior uveitis, AAU）和正常人外周静脉血，分离单核细胞并诱导为外周血单核细胞诱导的巨噬细胞（monocyte-derived macrophages，MDMs）。使用荧光定量PCR技术及流式细胞技术检测TLR2/4的表达；使用ELISA方法检测IL-1β表达水平；使用流式细胞技术检测线粒体受损及活性氧簇（reactive

oxygenspecies，ROS）产生水平；使用基因沉默技术使NLRP3低表达；使用流式细胞技术评价MAPK信号通路磷酸化水平。 结果： 1.活动期Behcet病患者MDMs细胞TLR2和TLR4表达明显高于静止期Behcet病患者、AAU患者和正常人。 2.活动期Behcet病患者MDMs产生IL-1β水平明显高于静止期Behcet病患者、AAU患者和正常人。PGN和LPS刺激MDMs后，可以明显升高各组IL-1β产生水平。但是，活动期Behcet病患者IL-1β升高水平明显高于其它各实验组，其它各实验组之间无明显差异。 3.活动期Behcet病患者体内MDMs细胞线粒体受损及ROS产生水平与静止期Behcet病患者、AAU患者和正常人相比明显升高；PGN和LPS可以使各组MDMs细胞线粒体受损及ROS产生水平明显增高，并且活动期Behcet病患者升高水平明显高于其它组；anti-TLR2/anti-TLR4可以明显降低PGN/LPS对MDMs细胞线粒体损伤和ROS产生作用；rotenone可以明显升高MDMs细胞ROS产生水平及IL-1β分泌水平，而DPI可以明显降低MDMs细胞ROS产生水平及IL-1β分泌水平。 www.selleck.cn/products/Bleomycin-sulfate.html 4.基因沉默炎症小体NLRP3后，各组IL-1β产生显著降低。 5. ROS通过激活p38和ERK1/2，进而激活炎症小体NLRP3，从而使IL-1β产生增多。 结论： 我们的结果显示：TLR2/4在活动期Behcet病患者MDMs细胞中表达明显升高。TLR2/4与其配体PGN/LPS相互作用可以使线粒体产生ROS增多，进而激活炎症小体NLRP3，从而使IL-1β产生增多引起炎症反应。 第二部分模式识别受体在Vogt-小柳原田综合征发病中作用的研究 目的： 探讨模式识别受体在Vogt-小柳原田综合征发病中所起的作用。 方法： 分别抽取活动期Vogt-小柳原田综合征患者、静止期Vogt-小柳原田综合征患者、AAU患者和正常人外周静脉血，分离单核细胞并诱导为巨噬细胞。使用荧光定量PCR技术及流式细胞技术检测TLR2/3/4的表达；使用ELISA方法检测IL-1β表达水平；使用流式细胞技术检测线粒体受损及活性氧簇（ROS）产生水平；使用基因沉默技术使NLRP3低表达；使用流式细胞技术评价MAPK信号通路磷酸化水平。 结果： 1.活动期Vogt-小柳原田综合征患者MDMs细胞TLR3和TLR4表达明显高于静止期Vogt-小柳原田综合征患者、AAU患者和正常人;TLR2表达在各组之间无明显差异。 2.

01,P
Aim:To investigate the mechanism of silibinin-protected isoproterenol-inducedapoptosis in rat cardiac myocytes.Methods:The viability of rat cardiac myocyteswas measured by MTT method.The apoptotic ratio was measured by terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labeling.Protein kinase C(PKC) activity assay was carried out according to the instructions of the PepTagnon-radioactive protein kinase C assay kit.Western blot analysis was used toevaluate the level of Ras,Raf-1 没有 and mitogen-activated protein kinase (MAPK)expression.Results:The protective effects of silibinin were significantly sup-pressed by inhibitors,including

genistein,manumycin A and GW5074 [inhibitorsfor protein tyrosine kinases (PTK),Ras and Raf-1,respectively].The Cilengitide exposure ofrat cardiac myocytes to isoproterenol alone caused decreased PKC activity,whichwas prevented by pretreatment with silibinin dose-dependently.Simultaneously,the increased expression of Ras and Raf-1 activated by silibinin were blocked bythe PKC inhibitor,stauroporine.In addition,the extracellularly responsive kinase(ERK) inhibitor,PD98059,suppressed silibinin-protected apoptosis,whereas thep38 MAPK inhibitor,SB203580,protected cardiac myocytes from isoproterenol-induced injury,and the c-Jun N-terminal

kinase (JNK) inhibitor,SP600125 had noprotective effects.Furthermore,Western

blot analysis showed that the expres-sion of phosphorylated ERK was increased by silibinin,the expression of phos-phorylated p38 MAPK was decreased and total ERK,p38,JNK and phosphory-lated JNK MAPK did not change after treatment with both isoproterenol andsilibinin.Furthermore,pretreatment of cardiac myocyte with PKC,Ras and Rafinhibitors significantly blocked ERK phosphorylation.Conclusion:Silibinin Saracatinib细胞系 issuggested to protect isoproterenol-induced rat cardiac myocyte apoptosis byactivating the tyrosine kinase pathway,PKC and MAPK pathways.
Aim:To investigate the effect of icariin on the expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1 alpha (PGC-1 α),peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARα),and nuclear respiratory factor 1 (NRF-1) oncardiomyocyte differentiation of murine embryonic stem (ES) cells in vitro.Methods:The cardiomyocytes derived from murine ES cells were verified byimmunocytochemistry using confocal laser scanning microscopy.Cardiac-specific sarcomeric proteins (ie α-actinin,troponin T) were evaluated when em-bryoid bodies (EB) were treated with icariin or retinoid acid.The expression ofPGC-1α,PPARα,and NRF-1 were analyzed using both semiquantitative RT-PCRand Western blotting in cardiomyocyte differentiation.

80±6.06),Ki-67阳性细胞百分比(0.42±0.04)下降,AK组织中Ki-67阳性细胞百分比(3.90±0.24)减少(p<0.05)。而SB431542添加后,TβRI磷酸化水平(0.0644±0.0053)减少(p6<0.05)；④在TGFβ1添加培养后,AK组织块中p53mRNA表达(0.00178±0.00010)增加,蛋白表达(0.1620±0.0155)增加,Fas蛋白表达(0.4004±0.0267)增加(p0.05)。 结论：1.紫外线照射可能通过抑制AK中TGFβ1/Smad信号通路,促进AK向SCC进展。2.紫外线抑制TGFβ1/Smad信号通路可能与诱导Smad7表达有关。
研究背景： 动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)作为心脑血管疾病的病理基础,目前已经成为威胁人类尤其是中老年人健康的最重要的疾病,由此导致的心脑血管意外发生率和死亡率极高,即使是在幸免的存活者中也仍然存在极高的致残率。动脉粥样硬化所涉及的致病因素极多,且其病理过程复杂,尽管此前已有诸多学说试图解释其发病机理,但其具体的发病及进展机制至今仍未明确。

诸多研究已经证实,动脉粥样硬化所致的临床急性缺血事件更多与斑块的稳定性密切相关,而非动脉管腔的狭窄程度。不稳定斑块破裂出血,并继发导致血栓形成已经成为临床急性心血管事件的主要病理机制。由此引入了易损斑块(Vulnerable Plaque)的概念,其作为具有极强破裂倾向的斑块,特点包括纤维帽在各种因素下逐渐变薄、坏死脂质核心逐渐增大、以巨噬细胞浸润为特征的斑块内活性炎症状态、平滑肌细胞逐渐减少以及胶原含量逐渐减少。并以此为依据引入易损指数,易损指数可以定量地评估斑块易损性,其定义为：易损指数＝(脂质占斑块面积百分比+巨噬细胞占斑块面积百分比)／(胶原占斑块面积百分比+平滑肌细胞占斑块面积百分比)。因此,探寻影响AS斑块稳定性的各种危险因素,并寻求能有效地稳定易损斑块的干预靶点,积极避免斑块破裂及继发的心脑血管事件成为近年来的研究热点。

Proteasome inhibition assay 既往研究证实血清淀粉样蛋白A (serum amyloid A, SAA)家族由SAA1、 SAA2、SAA3及SAA4四个家族成员构成。作为家族最主要组成成分的SAA1是SAA家族中表达最广泛、活性最强、反应最敏感的亚型。虽然在常态下SAA1表达水平较低,但在急性期状态下其血清浓度在极短时间内升高1000倍。血清SAA1主要由肝细胞合成并分泌,而其他组织细胞同样具有局部分泌SAA1的功能。在AS斑块内,SAA1可以由巨噬细胞合成分泌。此外,SAA在细胞膜上可能存在的受体包括：B型清道夫受体1(Scavenger receptor class B member1, SR-B I)、甲酰肽样受体1(formyl peptide receptor like-1, FPRL1)、Toll样受体(toll-like receptor, TLR)等。在不同细胞上SAA根据结合受体的类型,可能发挥不同的生物学作用。 {TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂|TNF alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂| 购买TNF-alpha抑制剂|TNF-alpha抑制剂半抑制浓度|TNF-alpha抑制剂 价格|TNF-alpha抑制剂 花费|TNF-alpha抑制剂溶解度|TNF-alpha抑制剂购买|TNF-alpha抑制剂制造商|TNF-alpha抑制剂研究购买|TNF-alpha抑制剂订单|TNF-alpha抑制剂小白鼠|TNF-alpha抑制剂化学结构|TNF-alpha抑制剂分子量|TNF-alpha抑制剂分子重量|TNF-alpha抑制剂数据表|TNF-alpha抑制剂供应商|TNF-alpha抑制剂体外|TNF-alpha抑制剂细胞系|TNF-alpha抑制剂浓度|TNF-alpha抑制剂核磁共振|TNF-alpha抑制剂体内|TNF-alpha抑制剂临床试验|TNF-alpha抑制剂s|TNF-alpha signaling抑制剂|TNF-alpha pathway抑制剂|TNF-alpha signaling pathway抑制剂|TNF-alpha signaling抑制剂s|TNF alpha pathway抑制剂s|TNF-alpha signaling pathway抑制剂s|TNF-alpha抑制剂 library|TNF-alpha activity inhibition|TNF-alpha activity|TNF-alpha inhibition|TNF-alpha抑制剂s library|TNF alpha抑制剂 libraries|TNF-alpha抑制剂 screening library|TNF-alpha high throughput screening|TNF-alpha抑制剂s high throughput screening|TNF-alpha phosphorylation|TNF-alpha screening|TNF-alpha assay|TNF-alpha animal study| 近年来,随着对SAA1的深入研究,人们发现SAA1与AS之间存在密切的联系。SAA1可在AS斑块进展的全程出现,并且血清SAA1的浓度与冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生成显著正相关。最新相关临床研究则发现,血清SAA1的水平可以作为一个独立的预测因素评估心血管急性事件的发生。这提示我们,SAA1对AS病程所发挥的作用可能不仅仅局限于斑块的形成阶段,而是通过某种作用机制进一步影响AS斑块的稳定性,并最终影响心血管急性事件的发生。影响AS斑块稳定性的因素是多方面的,涉及到巨噬细胞浸润、脂质沉积、平滑肌增殖迁移,细胞外基质降解及内皮细胞功能障碍等诸多环节。此前的研究一方面显示,SAA1可增加脂质沉积,加速脂核形成,通过促进单核巨噬细胞的趋化和粘附,增加了AS斑块中的炎症细胞浸润,这表明SAA1具有减弱斑块稳定性的作用；而另一些研究则表明SAA能增加平滑肌细胞的迁移和增殖,同时能刺激细胞外基质的表达增加,这又从另外方面表明SAA1具有增加斑块稳定性的作用。由此可见,SAA对AS斑块稳定性的影响是多方面的,甚至可能是双向的,基于以往的研究无法推断SAA对AS斑块稳定性的影响,目前尚存在以下问题亟待探讨和解决：①SAA1对动脉粥样硬化斑块稳定性的具体影响；②SAA1对动脉粥样硬化斑块内成分的影响；③SAA1发挥作用的信号通路。

研究目的： 1.通过转染SAA1慢病毒,明确SAA1高表达对AS斑块稳定性的影响； 2.探讨SAA1慢病毒转染对斑块内脂质、巨噬细胞、平滑肌细胞及胶原的影响； 3.通过体内外实验明确SAA1对胶原表达的影响及其相关信号通路。 研究方法： 1.SAA1高表达慢病毒的构建 获取目的基因后,经RT-PCR扩增后将目的基因片段与慢病毒载体plenti6.3-MSC-IRES-EGFP连接,构建成plenti6.3-SAA1-IRES-EGFP,并经转化、包装后测定慢病毒的滴度,用于实验。 和 2.动物饲养及建模 将100只6-8周龄的雄性ApoE-/-小鼠适应性喂养1周,给予颈动脉套管。继续高脂喂养8周后,随机将剩余的95只ApoE-/-小鼠分为4组:Control组(n=23)、lenti-null组(n=25、low-lenti-SAA1组(n=23)及high-lenti-SAA1组(n=24)。Lenti-null组给予1x107TU空慢病毒载体,low-lenti-SAA1组给予1×107TUSAA1高表达慢病毒,high-lenti-SAA1组1×109TUSAA1高表达慢病毒,control组给予相同体积生理盐水。继续高脂喂养4周后,小鼠空腹12小时,称体重,以0.8%戊巴比妥麻醉,打开胸腔,心脏取血,置于-80度冰箱保存,以备后续检测。以生理盐水灌洗心脏和主动脉,冲洗出残余血液。部分动物继以4%多聚甲醛固定直至肝脏变硬,收集小鼠套管近端的颈动脉,以4%多聚甲醛浸泡24小时。其余部分动物的颈动脉标本置于-80度冰箱保存。 3.酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 以ELISA法检测血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三脂及TNF-α、IL-6的浓度。 4.颈动脉油红O染色 对小鼠颈动脉进行5μm连续切片,每10张取1张用于油红O染色,病变的严重程度用斑块占颈动脉斑块面积的百分比来表示。 5.组织免疫组织化学染色 对冰冻切片行SAA1、α-SMC actin、MOMA-2、胶原I、胶原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8免疫组化染色观察SAA高表达对斑块SAA、α-SMC actin、 MOMA-2、胶原I、胶原Ⅲ、TGF-β1、MMP1、MMP8的影响。 6.