5%组细胞增殖抑制率均较含药血清30%组低(P<0.01),其余4组间无统计学差异；干预36h时,含药血清10%组,含药血清5%组,含药血清2.5%组细胞增殖抑制率均较含药血清20%组、含药血清30%组低(P<0.01),含药血清10%组,含药血清5%组,含药血清2.5%组三组间无统计学差异;干预48h时,含药血清10%组,含药血清5%组,含药血清2.5%组细胞增殖抑制率较含药血清30%组低(P<0.01～0.05),含药血清10%组,含药血清5%组,含药血清2.5%组三组间无统计学差异。给药浓度为30%含药血清时,干预48h,干预72h时各组细胞增殖抑制率较干预24h时明显增加(P<0.01),干预24h,干预72h时各组细胞增殖抑制率较干预36h时明显增加(P<0.01～0.05)；给药浓度为10%含药血清时,干预72h时各组细胞增殖抑制率较干预24h、干预36h时明显增加(P<0.05)；给药浓度为5%、2.5%含药血清时,各组无统计学差异。含药血清对细胞增殖的抑制率高低与浓度高低以及作用时间长短呈相关性。③划痕实验结果显示：空白血清组划痕间距较TGF-β1+空白血清组、TGF-β1+含药血清组均显著性增加(P
[目的]采用海人酸致痫SD大鼠模型,通过腹腔注射ALK5抑制剂(SB431542)干扰ALK5受体,观察癫痫大鼠海马组织中ALK1及其下游分子p-Smad1的mRNA及其蛋白的表达,研究癫痫大鼠ALK5对ALK1受体的作用,探讨可能的干预癫痫发作的新靶点。[方法]红藻氨酸(kainic
因为 acid, KA)侧脑室注入SD大鼠制备癫痫模型,随机分为KA模型对照组(A组)、ALK5 Inhibitor腹腔注射3d组(B组)、ALK5 Inhibitor腹腔注射7d组(C组),另设假手术组为生理盐水对照组(NC组),每组各10只。NC组、A组、B组分别于第3d,C组于第7d取海马,检测海马组织中ALK1和p-Smad1的mRNA及其蛋白的表达。[结果](1)免疫荧光组化结果显示：模型对照组ALK1和p-Smadl蛋白表达量较空白对照组表达增高(P0.05)。(2)荧光PCR结果显示：模型对照组ALK1和p-Smad1基因表达量较对照组表达增高(P0.05)。[结论](1)ALK5抑制剂腹腔注射后导致KA诱导的SD癫痫大鼠ALK1受体和p-Smad1表达下调。(2) TGF-β1—ALK5-p-Smad2/3对TGF-β1—ALK1-p-Smad1/5具有促进作用。
目的:探讨转化生长因子-β(TGF-β)Ⅰ型受体、Ⅱ型受体以及下游Smad蛋白在单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠模型肾脏中表达及意义。 寻找更多 方法:90只雌性Wistar大鼠随机分为正常对照组(CON组)、假手术组(SOR组)和单侧输尿管梗阻组(UUO组),分别于术后1d、3d、7d、14d、21d处死,观察各组大鼠肾功能变化;PAS染色观察大鼠肾间质病理形态改变;采用定时定量PCR基因芯片分析正常大鼠和不同分期肾间质纤维化大鼠肾组织TGF-βⅠ,Ⅱ型受体亚型表达,观察其丰度变化,结合肾组织的病理改变,筛选出有病理生理意义的TGF-βⅠ,Ⅱ型受体亚型。进一步应用Real-time
PCR,Western blot,和免疫荧光检测筛选出的TGF-β受体亚型mRNA和蛋白在肾间质纤维化大鼠肾组织的分布和表达。 结果:随时间延长,UUO组大鼠的血肌酐,血尿素氮与CON组比较均于术后第7天出现升高,并随梗阻时间延长逐渐增加,于21天达到最高峰(P<0.01),在第21天有所回落。ALK-6蛋白表达呈进行性下降(P<0.05),于14天达到最低(P
目的:研究α-1,6岩藻糖基转移酶(α-1,6 fucosyltransferase,FUT8)在TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞(Human kidney-2 ,HK-2)—肌成纤维细胞转分化(epithelial to mesenchymal
transition, EMT)中的作用。 方法:将体外培养的HK-2细胞随机分为三组:①(CON组)对照组常规培养;②(TGF组):加入浓分别为(5、10、20、40)ng/ml的TGF-β1刺激细胞;③(TGFF组):使用siRNA干扰技术沉默细胞的FUT8基因,随后再加入20ng/ml TGF-β刺激细胞。前期工作中,我们合成了荧光素标记的FUT8-siRNA并瞬时转染HK-2细胞,使用倒置荧光显微镜检测siRNA的转染效率;PT-PCR及FUT8免疫荧光技术分别检测FUT8-siRNA基因沉默效果及蛋白抑制率。刺激细胞72小时后,观察各组细胞形态学改变;分别使用western blot及免疫荧光技术检测细胞总FUT8蛋白及其底物α-1,6岩藻糖链的表达情况;此外使用免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)结合凝集素印迹检测特异性结合在TGF-βI/II型受体ALK-5(type Pazopanib体内 I receptor activin-like kinase 5)及TGF-βRII(TGF-βtype II receptor)上的岩藻糖链的表达;使用免疫荧光技术共染FUT8、ALK5进一步验证两者的定位及表达;随后,使用western blot及免疫组化染色技术对P-smad2/3进行评估;而α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)也使用免疫组化染色进行评估。 结果: RT-PCR及western blot检测结果显示FUT8-siRNA在100nM浓度下成功干扰HK-2细胞中FUT8基因及蛋白水平的表达,且转染效率达90%。使用相差显微镜观察CON组细胞呈正常地上皮细胞铺路石样形态;TGF组细胞发生明显的形态学改变,可见细胞肥大、拉长,提示发生成纤维化改变;而TGFF组可以一定程度的抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞形态的改变。与CON组相比, TGF组FUT8总蛋白表达升高(P0.05);TGFF组与TGF组相比,FUT8蛋白(P<0.01)及其底物岩藻糖链(P<0.05)表达都降低。IP结合凝集素印迹显示特异性结合在TGF-βRII的岩藻糖链的表达情况,TGF组与CON组相比表达上调(P<0.05),而TGFF组与TGF组相比明显下调(P<0.05);而TGFF组与TGF组比较,FUT8-siRNA可以阻断其上调(P<0.05);同样,α-SMA免疫组化结果显示TGF-β1可剂量依赖性上调其表达(P<0.