5nM),给予D组小鼠100μl的PI3K抑制剂CAL-101(浓度2.5nM)进行处理,A组小鼠作为空白对照不予任何处理。观察昆明小鼠成瘤情况和平均生存期,每周用游标卡尺测量肿瘤生长情况。3、流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测昆明小鼠外周血和脾脏细胞CD4+CD25+Foxp3调节性T细胞水平。4、逆转录-聚合酶链反应(1everse
transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测昆明小鼠脾脏中叉头转录因子Foxp3 mRNA的表达水平。5.Western Blot检测昆明小鼠脾脏细胞中PI3K蛋白表达。6、统计学处理：本实验使用SPSS13.0统计学软件分析数据,P<0.05),生存期明显延长,差异有统计学意义(P
目的:观察弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)中PI3K/AKT/mTOR的活化状态及其临床病理相关性,从信号传导调控的角度阐述DLBCL的发病机理,以期为DLBCL的诊断以及预后评估提供新的分子指标;从PI3K催化亚单位的层次初步探讨DLBCL中PI3K/AKT/mTOR通路活化的机制;另外建立DLBCL裸鼠移植瘤模型,通过体内实验探讨AKT信号传导通路对DLBCL细胞生长及其生物学效应的影响,以期为DLBCL的治疗提供新的思路。 ARRY-162分子重量 方法: 第一部分:收集复旦大学附属肿瘤医院病理科2002-2007年间新鲜DLBCL组织标本及相应石蜡组织75例,其中54例收集到随访资料;同时收集淋巴结反应性增生(reactive hyperplasia,RH)10例做对照。用免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)方法检测上述新鲜组织中pAKT、pmTOR的表达;同时用IHC法观察石蜡组织中Bcl6、CD10和MUM1的表达并据此将DLBCL分为生发中心B细胞样型(germinal Epigenetics合成 Library小白鼠 center-B cell like,GCB)和non-GCB两型,运用TaqMan实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time quantitativereverse transcription polymerase chain reaction,Real-time RT-PCR)技术检测Bcl6mRNA含量。分析pAKT、pmTOR在DLBCL及RH中表达的差异及其在DLBCL中的表达与分子分型、Bcl6表达及部分临床指标和预后的相关性。 第二部分:选取第一部分中54例新鲜组织较多者,实时定量RT-PCR方法检测PI3K4个催化亚单位的mRNA表达;另外收集RH新鲜标本9例同时进行检测。分析4个亚单位相对表达水平的高低,及在DLBCL和RH中表达水平的差异,以及与pAKT表达的相关性。选择76例新鲜DLBCL组织标本,酚-氯仿法提取基因组DNA后针对PIK3CA基因突变热点部位所在片段(外显子9和外显子20)进行PCR扩增及基因突变的检测分析。
第三部分:(1)无菌套管针抽吸法建立DLBCL裸鼠皮下移植模型,观察成瘤率和组织形态特点;用IHC法观察其免疫表型;用PCR扩增检测移植瘤组织和LY8细胞株的IgH克隆性重排和基因组DNA微卫星序列。(2)将荷瘤鼠(肿瘤大小均约200-400mm~3)随机分为3组,即对照组、低剂量LY294002组(0.1mg/kg)及高剂量LY294002组(0.5mg/kg),每组含10只裸鼠。每天给药连续10天。每周3次测量各移植瘤的体积(体积=1/2ab~2,其中a,b分别为移植瘤的长短径)。至第14天时牺牲裸鼠,HE染色观察移植瘤组织形态,IHC法检测Ki67表达并测定肿瘤细胞增殖活性,同时行Western blot方法检测AKT活化情况。并计算实体肿瘤质量抑瘤率和体积抑瘤率。(3)将荷瘤鼠(肿瘤大小均约600-800mm~3)随机分为4组,即6h处理组、18h处理组、24h处理组及48h处理组,每组4只裸鼠分别腹腔内注射对照(20%DMSO)、0.02mgLY294002、0.1mgLY294002或1.0mgLY294002。分别于给药一次后6h、18h、24h和48h牺牲裸鼠,采用流式细胞技术(flow cytometry,FCM)检测肿瘤细胞的细胞周期和细胞凋亡。(4)将荷瘤鼠(肿瘤大小均约200-400mm~3)随机分为4组,即单用LY294002(0.5mg/kg)组、单用阿霉素(doxorubicin,DOX)(5.0 mg/kg)组、LY294002(0.5mg/kg)与DOX(5.0 mg/kg)联合用药组以及对照组,每组含10只裸鼠。LY294002为每日给药连续10天,DOX为处理起始第1天和第3天给药。肿瘤体积观测、体积抑瘤率和质量抑瘤率计算、形态学观察及和细胞增殖活性检测大致同(2)。
结果: 第一部分:(1)pAKT和pmTOR在DLBCL中的阳性率分别为73.3%(55/75)和74.7%(56/75),二者的表达强度、阳性细胞分布基本一致。(2)non-GCB型DLBCL中pAKT和pmTOR的阳性率分别为82.5%(47/57)和84.2%(48/57),显著高于GCB型中的阳性率44.4%(8/18)和44.4%(8/18)(均p＜0.01)。(3)pAKT和pmTOR高表达组的Bcl6蛋白阳性率与mRNA水平均显著低于pAKT和pmTOR低表达或不表达者(均p＜0.01)。(4)pAKT和pmTOR阳性患者中乳酸脱氢酶(LDH)异常者高于阴性患者中的比例,差异达临界统计学意义(p=0.055)。pAKT和pmTOR的表达与性别、年龄、临床分期、KPS评分、B症状之间没有相关性(p＞0.05)。pAKT和pmTOR阳性患者的预后较阴性患者差,但差异没有显著性(p＞0.05)。 INCB28060细胞系 第二部分:(1)4个催化亚单位在DLBCL中按照mRNA表达水平从高到低依次是PIK3CD,-B,-A和-G。其中PIK3CD表达水平略高于PIK3CB(p＞0.05),显著高于PIK3CA和PIK3CG(p＜0.05)。(2)PIK3CB的表达也显著高于PIK3CA和PIK3CG(p＜0.05),并且PIK3CB在DLBCL中的表达显著高于RH中(p＜0.05)。(3)pAKT阳性组中PIK3CB和PIK3CD的表达水平均显著高于pAKT阴性组(p＜0.05)。(4)76例DLBCL中仅有1例检出了PIK3CA基因的突变,突变率为1.32%。(5)该病例共有3个突变位点,其一为c.1634A＞C,发生在曾报道的热点部位之一;另两个突变位点是c.1658G＞C的颠换和其后单个碱基(T)的缺失(c.1659delT),导致移码突变,该两个突变均未见文献报道,为新发现的突变类型。 第三部分:(1)运用LY8细胞株在裸鼠成功进行了人DLBCL细胞的种植,截至本次实验观察时已传至第9代,共移植裸鼠124只,其中114只成瘤,成瘤率达91.